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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于脱盐柱的问题
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amq7392

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 关于脱盐柱的问题

本人用 Sephadex G-25 Medium柱子脱盐，出来两个蛋白峰是怎么回事？所有的蛋白不是应该一起下来吗？所谓“盐峰”是什么？我要的产物在第一个峰，第二个峰活性很低。另外，请问脱盐的时候，用什么尺寸的柱子为好？是细长一些的还是粗短一些的？26X20cm柱子怎么样？我样品一般有十几毫升。
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1楼2012-03-05 15:46:49
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baicai1487

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2012-03-09 03:14:19
注意下面图片左上角的注释，cond=电导，cond%=电导率，这两个是表示盐的，A280是用于测定蛋白质的。每两条竖直的红线是每一次脱盐洗脱的循环，那一次我一共做了很多次，用的是AKTA纯化仪，层析柱是GE的desalting， ...

您好！我脱盐的时候也出现了您这种情况，我把盐峰之前的峰和盐峰下面的峰都收集好了，做了电泳分析，发现盐峰下面的峰有蛋白的，很疑惑
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17楼2013-11-18 14:05:20
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baicai1487

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-11-18 14:43:58
我也跑过，发现是没有的，因为时间比较久，图片已经没有了，但是对于我的酶来说，确实是全在第一个峰，也就是盐峰之前出来。我纯化了不同菌株来源的4个酶，都是这个情况，只是后面的3个酶测定了酶活力，确认了之后 ...

高手，我能否问个问题，就是除完盐后的蛋白还稳定吗？就是蛋白水液了
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19楼2013-11-18 16:39:37
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baicai1487

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
20楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-11-18 17:13:54
对于我的四个酶来说，稳定。...

那用水来透析的效果不是一样的吗？我今天把水透析的过了道G25，没有盐峰，除盐效果挺好的。但是用水透析有沉淀，我用PBS透析之后没沉淀，但是透析后的纯度不好算，因为蛋白里有PBS，结果纯度只有40%。用水透析有78%。我们老师要我把总蛋白纯度达到95%，我觉得好难呀，这个问题一直很困扰我，您是做蛋白的高手，我在很多帖子看过您，这次有机会跟您交流，很荣幸，希望您能提出宝贵意见，非常感谢
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21楼2013-11-18 17:39:56
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baicai1487

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-11-18 19:46:43
那你的蛋白质纯度是怎么算的？你之前说脱盐，现在说透析，到底是？？？...

透析液冻干成蛋白粉里含有蛋白的量，透析也是可以除盐的，我们老师叫我还得除小分子，所以我就得再过一道G25
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23楼2013-11-21 08:42:52
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baicai1487

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
24楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-11-21 15:23:23
你冻干之前有没有确认蛋白质是单条带？还是说你的蛋白质溶液是含有很多种蛋白质的？...

是总蛋白
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25楼2013-11-21 20:27:48
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baicai1487

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
26楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-11-21 21:33:33
这我就不理解了，既然是总蛋白质，含有多种多样的蛋白质，或许就真有的蛋白质会损失掉。而且，如果你提取总蛋白质的方法造成蛋白质变性，那么结果就更难说了。如果有的蛋白质只保留一级结构，那就很可能溶解性很差 ...

嗯，我的蛋白损失我已经预料到了，现在我又测到里面含糖了，有百分之7.6%，可能是糖蛋白了，所以我总蛋白的纯度要达到百分之九十五太难了
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27楼2013-11-22 18:20:32
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baicai1487

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
28楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-11-22 20:00:55
有糖蛋白是很正常的，但是如果把糖去除会影响蛋白质的活性。...

大侠，我现在真的很疑惑，做个总蛋白别人一直很质疑，纯度的问题，我用水透析损失量太大了，有沉淀，沉淀中还含蛋白，得到的蛋白量很少。用PBS透析的话，PBS又在里面，纯度又不好测，很疑惑。老师又说蛋白里可能还有二萜，所以我又想过道G25，但是过完G25又出现双峰的情况，就是盐峰下面出现蛋白峰，我的实验就卡那儿了，您是蛋白高手，能不能帮我一下，不甚感激。
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29楼2013-11-23 09:45:24
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baicai1487

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
30楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-11-23 14:54:19
你是提取什么样品的总蛋白质？这个样品具体怎样得来？怎样提取的？...

PBS提取，硫酸铵沉淀，再用PBS复溶，透析除盐，G25除小分子，冻干成粉，测冻干粉里的蛋白纯度
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32楼2013-11-25 11:50:34
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baicai1487

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
33楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-11-25 18:56:05
G25可以同时去除小分子的，包括硫酸铵。硫酸铵是会造成一些蛋白质变性的，在我尝试纯化的10个蛋白质中，就有2个是不耐硫酸铵的。如果你不需要3KD以下的寡肽，你可以超滤提取。...

我现在最担心的就是用G25除小分子会把所有的盐除去，总蛋白中没有缓冲盐会不稳定
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34楼2013-11-28 10:21:42
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