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xy19860508铜虫 (小有名气)
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[求助]
反转录之后PCR扩增片段问题的请教，急急急
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小弟，最近在对流感病毒的HA基因片段进行扩增（先提RNA进行反转录，完成之后再进行的扩增），在扩增之前为保证RNA模板的存在，先用HA基因的小片段引物（300bp）进行扩增，呈阳性之后才做的大片段（1700bp）扩增。图1为我做的退火温度梯度的图片，在D,G泳道出现了明显的目的条带，但是E泳道不知道是什么东西。 但是在确定好的条件下，再用样本进行PCR扩增是，没有目的条带出现，而呈现出图2这种情况。不知道这种情况为什么东西导致的，求教。。(为什么同样的反应条件，试剂也是一样的，则出现完全没有目的条带呢) 在找不到原因的情况下，我又重新抽提了RNA，并且也做了短片段的扩增，没有问题之后。用保真酶来扩增大的片段，则呈现出了以下的情况，求解答。 小弟在此求教，急啊。赶着毕业啊，请大家多多指点，拜谢了  为退火温度优化   保真酶的扩增图片 |
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【答案】应助回帖
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xy19860508(金币+10): 2012-02-25 12:25:26
wanhscn(金币+5, MolEPI+1): 很好！欢迎继续解答，必要时将授予专家指数！ 2012-02-25 15:56:57
xy19860508: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-05-04 12:10:31
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xy19860508: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-05-04 12:10:31
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1.从图A中看，虽然你做了退火温度的优化，但是可以看见很明显的非特异条带，说明你的引物的特异性并不是太好。。而且我不明白你设计300bp的目的片段作为鉴定的依据，我觉得可以把目的片段的大小设计的大点。 2.及时是之前鉴定的阳性的，再下一次PCR中也有可能出不来，具体原因很多，就把它作为系统误差吧，没必要较真，只要再做两次实验，能出符合自己的结果就行了。 3.高保真的扩增效率是不及普通Taq酶的，所以酶量可以提高点。 我的建议： 1看你做的是AIV的哪个型，仔细考虑你的引物的特异性；。 2可以用HOFFMAN的通用引物试试，再不行重新设计引物测出你所需要的序列的全长； 3在获得一般序列的基础上再调整引物用高保真酶扩增获得真实的全长。 祝你好运。 |
2楼2012-02-25 12:15:42
xy19860508
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3楼2012-02-25 12:25:06
xy19860508
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4楼2012-02-25 12:28:17
5楼2012-02-26 12:11:30
【答案】应助回帖
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300bp跑出来条带不怎么亮，说明cDNA质量不高的可能性很大。 高保真酶的扩增效率要低一些，可能导致扩增失败。 建议你从提高cDNA质量的几个方面入手，如：1.提高病毒液里病毒的滴度；2.提高RNA提取的操作水平；3.更换反转录试剂，如果试剂放久了就换新的；如果是比较便宜的低端产品，换成高端一点的。takara有一个一步法RT-PCR的盒子，可以试试，比较适合新手用。4.PCR的时候cDNA用量增大一点。25微升体系加4微升模板试试。5.个人觉得退火温度优化意义不大，固定用较低温度，比如52度左右就可以了。最多有点非特异行条带，影响不大。 |
6楼2012-05-02 13:32:02