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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Sau 3AI 酶切DNA片段 无带怎么回事？
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liulianwei

铁虫 (初入文坛)

[交流] Sau 3AI 酶切DNA片段 无带怎么回事？ 已有4人参与

大家好,我现在在做微卫星标记的开发，第一步就是DNA片段的酶切,内切酶为Sau 3AI ，1ul，10×H Buffer 2 ul , DNA片段量（做了梯度），加水补足20ul。37°消化4h，然后65°10min,(后来又试了80°20min)终止反应，内切酶后来也换新的，电解液也换新的，DNA模板检测了也没有问题，连续做了5次，电泳还是没有带。现在实在是分析不出来原因，请大家多多指点啊，谢谢！我也没有金币啦，第一次在上面求助，希望大家多多帮助啊！
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宥
1楼 2012-02-17 20:13:03
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★
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是没有切开还是切的没有条带了？上图吧，问题都没有描述清楚。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2012-02-17 23:01:34
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liulianwei

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by brightfuture01 at 2012-02-17 23:01:34:
是没有切开还是切的没有条带了？上图吧，问题都没有描述清楚。

跑电泳什么也没有啊，就是没有带啊
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宥
3楼2012-02-18 01:31:19
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redlizi

木虫 (正式写手)
★
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多少体系？加多少基因组来酶切，又是用的多少来电泳检测？电泳时可用等量未酶切的来对照，很可能是酶切的比较完全，量又太少，所以看不出来了
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4楼2012-02-18 09:32:53
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liulianwei

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by redlizi at 2012-02-18 09:32:53:
多少体系？加多少基因组来酶切，又是用的多少来电泳检测？电泳时可用等量未酶切的来对照，很可能是酶切的比较完全，量又太少，所以看不出来了

20ul体系，DNA（0.5ul/1ul2个梯度，DNA亮度还行，以前跑pcr的时候0.5ul就能跑出片段），最后全部用来电泳，准备切胶啊。“等量的未酶切来对照，”指的是DNA模板吗。“很可能是酶切的比较完全，量又太少，所以看不出来了。”意思是DNA模板少了？
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宥
5楼2012-02-18 10:07:59
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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引用回帖:
5楼: Originally posted by liulianwei at 2012-02-18 10:07:59:
20ul体系，DNA（0.5ul/1ul2个梯度，DNA亮度还行，以前跑pcr的时候0.5ul就能跑出片段），最后全部用来电泳，准备切胶啊。“等量的未酶切来对照，”指的是DNA模板吗。“很可能是酶切的比较完全，量又太少，所以看不 ...

酶加过了，切的时间太长了。你要知道Sau3AI 是四碱基识别酶。理论上，基因组上平均256bp就有一个酶切位点，如果切的时间太长，酶加太多的话，切成弥散的火箭状了。
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6楼2012-02-18 10:29:59
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森林有木

银虫 (初入文坛)
★
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你家的模板太少啦，电泳点样估计你也点的很少所以看不出来
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笑笑别人 笑笑自己
7楼2012-03-05 15:36:25
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他她0328

银虫 (小有名气)
★
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1.酶量太大，这个酶是10U/ul，你的体系是20ul，加10U的酶，量确实过大。
2.酶切时间太久，我回收的片段大些，酶切时间几分钟就好了，而且酶浓度是0.01U/ug，所以建议你适当缩短酶切时间，降低酶浓度。
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8楼2012-03-06 13:35:50
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