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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 溶解曲线的问题
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bffgbgff

新虫 (小有名气)

[求助] 溶解曲线的问题

我做的realtime-PCR，1-4号模板P其他的基因都很好，唯独这个基因溶解曲线不好，相同的引物在不同的模板间溶解曲线不一样。是为什么呢？见图。
不知道哪位前辈遇到过这个问题！
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1楼 2012-01-13 15:50:32
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海阔天空8158

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+6, MolEPI+1): 很热心帮忙，授予EPI！ 2012-01-18 19:07:48
引用回帖:
7楼: Originally posted by bffgbgff at 2012-01-16 15:50:19:
多谢意见。我1ugRNA逆转录后，我用nanodrop2000测过单链cDNA浓度。和其他样本基本无差别，PCR时，模板稀释了10倍！1，2,3,4，GAPDH的CT值都是18左右。另外引物稀释过一倍，还是这个样子！打算重新收集一批RNA再重 ...

按照现在的实验条件和你现在的描述，由于没有足够的模板，引物因此没有经过消耗。这样的话，如果引物能够形成二聚体的话，会很大比例的形成二聚体。

关于引物二聚体的形成难易程度，可以在PRIMER PREMIER 5.0中进行验证。

或者，可以通过文献查找的方法，合成比较成熟的引物。

如果时间允许的话，这些都可以试试。

祝实验顺利。
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天行健，君子以自强不息；地势坤，君子以厚德载物。
8楼2012-01-16 16:40:52
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海阔天空8158

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+5): 欢迎应助，常来啊 2012-01-14 21:34:11
楼主能不能把横坐标一起粘过来啊？这样更有利于确定原因。

一般来说出现小峰的原因包括:
1第四组对应的样品中核酸污染，造成非特应性扩增。
2引物二聚体峰：（可能是在加引物过程中掺杂了其他引物，或者引物浓度的原因）

另外，可以排除一下最后样品中是不是有基因组DNA的污染。

祝实验顺利。
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天行健，君子以自强不息；地势坤，君子以厚德载物。
2楼2012-01-14 17:38:21
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
西瓜(金币+2, 专家考核): Good！ 2012-01-15 11:33:52
相同的引物在不同的模板间溶解曲线不一样。如果是退火温度不一样的话，很有可能是有基因组DNA的污染或是非特异性的扩增，带来的产物不均一。
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jiayoubashaonian
3楼2012-01-14 17:53:11
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bffgbgff

新虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 海阔天空8158 at 2012-01-14 17:38:21:
楼主能不能把横坐标一起粘过来啊？这样更有利于确定原因。

一般来说出现小峰的原因包括:
1第四组对应的样品中核酸污染，造成非特应性扩增。
2引物二聚体峰：（可能是在加引物过程中掺杂了其他引物，或者引物 ...

重复过一次，结果还是这个样子，排除加错引物的可能，PCR完了后跑了个电泳，3,4号样品目的基因很弱，引物二聚体很强。无杂带出现！，十分不解原因。
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4楼2012-01-15 14:39:55
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