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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 溶解曲线的问题
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bffgbgff

新虫 (小有名气)

[求助] 溶解曲线的问题

我做的realtime-PCR，1-4号模板P其他的基因都很好，唯独这个基因溶解曲线不好，相同的引物在不同的模板间溶解曲线不一样。是为什么呢？见图。
不知道哪位前辈遇到过这个问题！
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1楼 2012-01-13 15:50:32
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回帖置顶 ( 共有1个 )

海阔天空8158

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+6, MolEPI+1): 很热心帮忙，授予EPI！ 2012-01-18 19:07:48
引用回帖:
7楼: Originally posted by bffgbgff at 2012-01-16 15:50:19:
多谢意见。我1ugRNA逆转录后，我用nanodrop2000测过单链cDNA浓度。和其他样本基本无差别，PCR时，模板稀释了10倍！1，2,3,4，GAPDH的CT值都是18左右。另外引物稀释过一倍，还是这个样子！打算重新收集一批RNA再重 ...

按照现在的实验条件和你现在的描述，由于没有足够的模板，引物因此没有经过消耗。这样的话，如果引物能够形成二聚体的话，会很大比例的形成二聚体。

关于引物二聚体的形成难易程度，可以在PRIMER PREMIER 5.0中进行验证。

或者，可以通过文献查找的方法，合成比较成熟的引物。

如果时间允许的话，这些都可以试试。

祝实验顺利。
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天行健，君子以自强不息；地势坤，君子以厚德载物。
8楼2012-01-16 16:40:52
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普通回帖

海阔天空8158

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+5): 欢迎应助，常来啊 2012-01-14 21:34:11
楼主能不能把横坐标一起粘过来啊？这样更有利于确定原因。

一般来说出现小峰的原因包括:
1第四组对应的样品中核酸污染，造成非特应性扩增。
2引物二聚体峰：（可能是在加引物过程中掺杂了其他引物，或者引物浓度的原因）

另外，可以排除一下最后样品中是不是有基因组DNA的污染。

祝实验顺利。
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天行健，君子以自强不息；地势坤，君子以厚德载物。
2楼2012-01-14 17:38:21
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
西瓜(金币+2, 专家考核): Good！ 2012-01-15 11:33:52
相同的引物在不同的模板间溶解曲线不一样。如果是退火温度不一样的话，很有可能是有基因组DNA的污染或是非特异性的扩增，带来的产物不均一。
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jiayoubashaonian
3楼2012-01-14 17:53:11
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bffgbgff

新虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 海阔天空8158 at 2012-01-14 17:38:21:
楼主能不能把横坐标一起粘过来啊？这样更有利于确定原因。

一般来说出现小峰的原因包括:
1第四组对应的样品中核酸污染，造成非特应性扩增。
2引物二聚体峰：（可能是在加引物过程中掺杂了其他引物，或者引物 ...

重复过一次，结果还是这个样子，排除加错引物的可能，PCR完了后跑了个电泳，3,4号样品目的基因很弱，引物二聚体很强。无杂带出现！，十分不解原因。
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4楼2012-01-15 14:39:55
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bffgbgff

新虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by blackrose8089 at 2012-01-14 17:53:11:
相同的引物在不同的模板间溶解曲线不一样。如果是退火温度不一样的话，很有可能是有基因组DNA的污染或是非特异性的扩增，带来的产物不均一。

跑电泳，无杂带出现啊。是不是目的基因表达很弱的原因
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5楼2012-01-15 14:40:53
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海阔天空8158

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
bffgbgff(金币+2): ★有帮助 2012-01-16 15:50:59
小丹木木(金币+2): 鼓励应助，多多交流哦 2012-01-16 16:39:55
引用回帖:
4楼: Originally posted by bffgbgff at 2012-01-15 14:39:55:
重复过一次，结果还是这个样子，排除加错引物的可能，PCR完了后跑了个电泳，3,4号样品目的基因很弱，引物二聚体很强。无杂带出现！，十分不解原因。

通过楼主的回复，应当是目的基因转录后得到的RNA浓度太低。但是，与其他样品（1和2）相比，使用的引物量虽然相同，但是相对的引物量太高。使本来不明显的引物二聚体现象非常明显。

建议楼主降低3号和4号中的引物使用量。这样引物二聚体会降低。

另外，可以试一下在正式实验前，根据内参，调整以下RNA的浓度（适当稀释）。


祝实验顺利。
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天行健，君子以自强不息；地势坤，君子以厚德载物。
6楼2012-01-16 11:30:37
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bffgbgff

新虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 海阔天空8158 at 2012-01-16 11:30:37:
通过楼主的回复，应当是目的基因转录后得到的RNA浓度太低。但是，与其他样品（1和2）相比，使用的引物量虽然相同，但是相对的引物量太高。使本来不明显的引物二聚体现象非常明显。

建议楼主降低3号和4号中的引 ...

多谢意见。我1ugRNA逆转录后，我用nanodrop2000测过单链cDNA浓度。和其他样本基本无差别，PCR时，模板稀释了10倍！1，2,3,4，GAPDH的CT值都是18左右。另外引物稀释过一倍，还是这个样子！打算重新收集一批RNA再重复。
如果样本不表达这个基因的话，是不是引物就基本成了引物二聚体了？？
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7楼2012-01-16 15:50:19
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+1, 专家考核): make 2012-01-18 20:42:45
引用回帖:
8楼: Originally posted by 海阔天空8158 at 2012-01-16 16:40:52:
按照现在的实验条件和你现在的描述，由于没有足够的模板，引物因此没有经过消耗。这样的话，如果引物能够形成二聚体的话，会很大比例的形成二聚体。

关于引物二聚体的形成难易程度，可以在PRIMER PREMIER 5.0 ...

有一定道理。楼主可以看看扩增曲线，看看PCR反应有没有到达平台期。如果模板浓度低的样品没有到达平台期，说明PCR体系还没消耗尽，那可能就是 海阔天空8158 说的情况。
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9楼2012-01-18 19:07:16
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