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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助，Western-Blot转膜不成功
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shenxing325

铜虫 (小有名气)

[求助] 求助，Western-Blot转膜不成功

各位虫友，做了两次Western-Blot转膜都不成功，想各位帮我指点一下可能的原因，这些是我做实验的时候的条件细节：
        目的蛋白大小100kD左右，用的是湿转法，电转缓冲液（5×）的配方是：
        Glycine   15.1g
        Tris         72g
        SDS        5g
        定容至一升，使用前取200mL，再加700mL水和100mL甲醇，4度备用
        滤纸（3mm滤纸用两边各用两层）比膜和胶大比较多，之前看过一些人说滤纸要比膜小，但是好像大多数人都说对于湿转来说没有关系。
        膜用的是0.45um的PVDF膜，这个有人说要用0.22um的，是这样吗？
        电转于4度冰柜中进行，80V电压，时间2h，用立春红染色，但是什么都没有，我没有用预染Marker。
       看大多数人都说湿转是非常容易成功的，我的实验操作哪里有问题吗？请指教，谢谢！
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1楼 2012-01-12 17:51:39
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314300420

捐助贵宾 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
SDS含量过高，降低10倍即可
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9楼2012-01-14 17:29:38
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查看全部 23 个回答

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
也有可能是转过头……
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2楼2012-01-12 21:14:25
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山东老杜

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
电压低点

怎么不加个预染marker
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3楼2012-01-12 22:34:14
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dnaxxx

至尊木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我用的是NC膜，一般喜欢用300mA横流转1个小时或者90分钟（大分子），从来没有出过问题。
没用过PVDF膜，所以不知道你的电压条件什么的是不是合适，不过PVDF膜需要先用甲醇活化正电基团，不知道你活化了没有。
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4楼2012-01-13 07:25:42
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