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churchill87426

木虫 (正式写手)

[求助] 酶切验证突变,但每个样品都有突变?!求助,求方法。

小弟发现一个突变位点,是TC突变。现在收集了些病人的样本。准备验证突变发生的概率。选择的是PCR产物酶切的方法。
我将样品提取基因组后(Takara试剂盒从血液提,或组织切片提取),PCR目的条带200bp胶回收,然后用识别突变位点的内切酶(HpyCH4IV,NEB,识别位点ACGT)酶切。结果发现每个样品都能切开,也就是每个样品都有突变。这个不太可能吧?!并且连正常人的样本都有突变的存在!求助!!!有可能是酶的非特异切割么?

或者有其他较低成本,较可靠的检测突变的方法么?我们准备先做50-100个样品。

因本人是做药筛的,突变只是偶然发现,还请多多指教。
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churchill87426

木虫 (正式写手)

正常的基因序列是XXXACGCXXXX,突变形式是XXXACGTXXX,因实验保密性,故不能把全序列写上。
我PCR 目的片段189bp,包含上述突变位点,PCR后切胶回收,并用HpyCH4IV酶切(酶切A'CG'T),然后跑15%PAGE胶,银染。理论上,若存在突变,跑胶后则会有124bp和65bp两个片段;若无突变,则只有189bp。但酶切了30+个样品,都是2个条带,which means都有突变!包括正常人的样品也有突变,感觉比较奇怪。有可能是酶的非特异切割么?

或者有其他较低成本,较可靠的检测突变的方法么?
3楼2012-01-05 13:18:17
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panda73

金虫 (小有名气)

问题表述不清楚,你至少得告诉大家突变前是什么序列,突变后是什么序列,以及周边序列,你的实现设计,实验结果等
2楼2012-01-05 11:34:08
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