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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 酶切验证突变，但每个样品都有突变？！求助，求方法。
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churchill87426

木虫 (正式写手)

[求助] 酶切验证突变，但每个样品都有突变？！求助，求方法。

小弟发现一个突变位点，是TC突变。现在收集了些病人的样本。准备验证突变发生的概率。选择的是PCR产物酶切的方法。
我将样品提取基因组后（Takara试剂盒从血液提，或组织切片提取），PCR目的条带200bp胶回收，然后用识别突变位点的内切酶（HpyCH4IV，NEB，识别位点ACGT）酶切。结果发现每个样品都能切开，也就是每个样品都有突变。这个不太可能吧？！并且连正常人的样本都有突变的存在！求助！！！有可能是酶的非特异切割么？

或者有其他较低成本，较可靠的检测突变的方法么？我们准备先做50-100个样品。

因本人是做药筛的，突变只是偶然发现，还请多多指教。
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1楼 2012-01-04 19:33:18
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panda73

金虫 (小有名气)
问题表述不清楚，你至少得告诉大家突变前是什么序列，突变后是什么序列，以及周边序列，你的实现设计，实验结果等
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2楼2012-01-05 11:34:08
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churchill87426

木虫 (正式写手)
正常的基因序列是XXXACGCXXXX，突变形式是XXXACGTXXX，因实验保密性，故不能把全序列写上。
我PCR 目的片段189bp，包含上述突变位点，PCR后切胶回收，并用HpyCH4IV酶切（酶切A'CG'T），然后跑15%PAGE胶，银染。理论上，若存在突变，跑胶后则会有124bp和65bp两个片段；若无突变，则只有189bp。但酶切了30+个样品，都是2个条带，which means都有突变！包括正常人的样品也有突变，感觉比较奇怪。有可能是酶的非特异切割么？

或者有其他较低成本，较可靠的检测突变的方法么？
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3楼2012-01-05 13:18:17
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