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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 连接与转化问题
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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)

[求助] 连接与转化问题

各位高手你们好！我想请教大家一个问题：我最近做基因串联，我的基因是重复的片段，我分别扩出两段大小相同的片段，大小都是357bp，然后通过中间设计的一个相同的限制性内切酶（HindIII)，然后我在一个体系里把这两段片段和载体连接起来，跟载体连接时我选的两端的酶是（EcoR I,Xho I),然后就是转化，挑菌，但是提完重组质粒用它做pcr鉴定是啥也没做出来，做双酶切时有两条带但是那个小片段的条带按说连上应该是684bp，但是跑电泳确在750bp处，我用的是2000bp的Market，这是不是意味着我连上的不对啊，高手指导指导啊！谢谢了！或者有谁能给指条更好地连接方法，针对这种重复片段需要串联的，谢谢了！
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1楼 2011-12-21 20:05:48
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
方法是可行的，
去测序吧，必须的…………
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2楼2011-12-22 09:05:49
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yabxxh

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个没错，直接测序。因为你不光要考虑基因本身的大小，还要考虑引物两端的酶切位点和保护碱基，...，357+357+6+12+5=737，接近750啊，怎么你算得684，是怎么得来的。
大胆去测序吧
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3楼2011-12-22 11:31:28
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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by yabxxh at 2011-12-22 11:31:28:
这个没错，直接测序。因为你不光要考虑基因本身的大小，还要考虑引物两端的酶切位点和保护碱基，...，357+357+6+12+5=737，接近750啊，怎么你算得684，是怎么得来的。
大胆去测序吧

我的那两段357bp基因的上面加着酶切位点和保护碱基的，然后一段用EcoRI和HindIII双酶切，一段用HindIII和Xho I双酶切，第一段双酶切后还剩348bp，第二段双酶切后剩342bp，然后连接时因为都有HindIII在减去六个碱基，就在EcoRI和Xho I双之间还剩684bp了，但是我pcr鉴定却一直跑不出条带？不过我也去测序了！再指导一下吧！
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4楼2011-12-22 19:39:56
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20083630zhan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

3楼的说法不实很准确，我们酶切的时候会将引物设计时前面所加的保护碱基一并切除，所以，如果你连上了那你的上面根本就没有保护碱基
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5楼2013-05-19 09:40:24
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yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

j菌落PCR引物可是在载体上设计的？还有琼脂糖电泳，目的条带的大小并不十分准确，跑PAGE胶用银染，可区别分子量较低的条带，从胶中估计得分子量较准。
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6楼2013-05-19 22:38:41
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