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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)

[求助] 连接与转化问题

各位高手你们好!我想请教大家一个问题:我最近做基因串联,我的基因是重复的片段,我分别扩出两段大小相同的片段,大小都是357bp,然后通过中间设计的一个相同的限制性内切酶(HindIII),然后我在一个体系里把这两段片段和载体连接起来,跟载体连接时我选的两端的酶是(EcoR I,Xho I),然后就是转化,挑菌,但是提完重组质粒用它做pcr鉴定是啥也没做出来,做双酶切时有两条带但是那个小片段的条带按说连上应该是684bp,但是跑电泳确在750bp处,我用的是2000bp的Market,这是不是意味着我连上的不对啊,高手指导指导啊!谢谢了!或者有谁能给指条更好地连接方法,针对这种重复片段需要串联的,谢谢了!
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
方法是可行的,
去测序吧,必须的…………
2楼2011-12-22 09:05:49
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yabxxh

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
这个没错,直接测序。因为你不光要考虑基因本身的大小,还要考虑引物两端的酶切位点和保护碱基,...,357+357+6+12+5=737,接近750啊,怎么你算得684,是怎么得来的。
大胆去测序吧
3楼2011-12-22 11:31:28
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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
: Originally posted by yabxxh at 2011-12-22 11:31:28:
这个没错,直接测序。因为你不光要考虑基因本身的大小,还要考虑引物两端的酶切位点和保护碱基,...,357+357+6+12+5=737,接近750啊,怎么你算得684,是怎么得来的。
大胆去测序吧

我的那两段357bp基因的上面加着酶切位点和保护碱基的,然后一段用EcoRI和HindIII双酶切,一段用HindIII和Xho I双酶切,第一段双酶切后还剩348bp,第二段双酶切后剩342bp,然后连接时因为都有HindIII在减去六个碱基,就在EcoRI和Xho I双之间还剩684bp了,但是我pcr鉴定却一直跑不出条带?不过我也去测序了!再指导一下吧!
4楼2011-12-22 19:39:56
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20083630zhan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

3楼的说法不实很准确,我们酶切的时候会将引物设计时前面所加的保护碱基一并切除,所以,如果你连上了那你的上面根本就没有保护碱基
5楼2013-05-19 09:40:24
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yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

j菌落PCR引物可是在载体上设计的?还有琼脂糖电泳,目的条带的大小并不十分准确,跑PAGE胶用银染,可区别分子量较低的条带,从胶中估计得分子量较准。
6楼2013-05-19 22:38:41
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