应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大家帮忙分析下双向电泳结果不好的原因（有图）
51/1返回列表
查看: 2719  |  回复: 11
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

求索寻觅

金虫 (小有名气)

[求助] 大家帮忙分析下双向电泳结果不好的原因（有图）

裂解液配方是：7M尿素，2M硫尿，4%CHAPS，0.3% Bio-lyte，65 mM DTT，加入了罗氏蛋白酶抑制剂。大鼠肝脏在液氮中研磨，大约0.1 g肝脏加入了1ML裂解液，然后冰浴超声了1分钟（就是放进去超声零点几秒然后拿出1秒，再放进去，搞了1分钟）。冰上裂解1h后，35000 g离心 90 min（这个转速已经是我们实验的极限了）。吸取上清做后续实验。
    测定了蛋白浓度大概为20mg/ml，水化时吸取了100ul 加入400ul 水化缓冲液（水化缓冲液配方和裂解液一致），上样450ul进行水化，我做的是24cm的胶条，ph 3-10。我做了三根胶条，2根在水化缓冲液家了DTT，第三根加了 TBP（据说TBP可以很好的解决碱性端横纹的问题）。水化了大概14h，然后进行等点聚焦。程序如下
   100v  缓慢 1h
   200v 缓慢 1h
   500v 缓慢  1h
  1000v 缓慢 1h
10000v 线性 4h
10000v 快速 100000v.H
500 v    快速  24h
   聚焦后用的gel胶为10%的，先用50v，再用200v跑完。
    结果如下图，分别为1，2，3，左边是正极端。请大家帮忙分析下原因，不甚感激。
ps：我已经做了几个月了，结果总这样差不多烂，别人论文里面也是这样，但是图谱上蛋白点多很多，也分散的均匀，实在想不明白。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

电泳、bio-rad 电转化仪及操作

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-12-21 14:26:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rinp

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
求索寻觅(金币+1): 谢谢建议。我加了罗氏的蛋白酶抑制剂，是那种片剂，能抑制多种蛋白酶的。因为加了蛋白酶抑制剂，我想应该加入核酸酶也没效果了，会被抑制，你说是吗？ 2011-12-30 22:29:50
1你为什么不加蛋白酶抑制剂比如PMSF，EDTA，这可能是你蛋白损失的重要原因之一，要不就是你离心太久了，我都是20000g30min的
2 DTT有点多吧
3 为什么不加点核酸酶
4你的胶为虾米都不加marker的
赞一下 回复此楼
海到无边天做岸山登绝顶我为峰.博士学位就是鞋里的一粒米，不拿不舒服，拿了不能吃！
3楼2011-12-22 10:03:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答

zjkown

木虫 (初入文坛)
碱性端聚焦不好； 100000V.H 好像有点多，可以尝试缩短聚焦V.H数。（缩短后有可能会造成酸性端又聚焦不够，所以可能需要找到平衡点）。 二向可以试试4-5%的浓缩胶+10-12%的分离胶。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-12-22 06:44:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Rubisco580

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
求索寻觅(金币+1): ★有帮助 我的IPG Buffer的配方和裂解液大致相同，就是我说的水化上样缓冲液，只是两性载体浓度有差别。您能不能具体给我说下，谢谢啊。 2011-12-30 22:32:29
1.裂解液水化液不加 IPGBuffer？
2.上样量怎么那么大？我做的时候上200~300 ug，聚焦50000Vhrs。只有质谱的时候才上这么大量聚焦100000 Vhrs。
3.胶条行不行？有时候差的胶条聚焦是会不好的。
希望有帮助
赞一下 回复此楼
4楼2011-12-22 16:35:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

求索寻觅

金虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by zjkown at 2011-12-22 06:44:19:
碱性端聚焦不好； 100000V.H 好像有点多，可以尝试缩短聚焦V.H数。（缩短后有可能会造成酸性端又聚焦不够，所以可能需要找到平衡点）。 二向可以试试4-5%的浓缩胶+10-12%的分离胶。

第二向还能再用浓缩胶吗？能不能给点这方面的资料。谢谢你的建议。
赞一下 回复此楼
5楼2011-12-30 22:27:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[教师之家] 又一批高校组建人工智能学院 师资行吗 不是骗人吗 +6 yexuqing 2026-04-19 7/350 2026-04-23 12:32 by yexuqing
[基金申请] 国自然面上和省基金B类撒花 +18 花田半亩～白 2026-04-21 18/900 2026-04-23 11:31 by 12021227
[考研] 有没有学校收留 +3 蒋昌鹏qtj 2026-04-20 3/150 2026-04-22 20:25 by 学员JpLReM
[考博] 华师大读博 +3 xq83 2026-04-22 5/250 2026-04-22 10:42 by xq83
[论文投稿] 急需审稿人！！！ +3 陆小果画大饼 2026-04-21 3/150 2026-04-21 23:54 by jzy_123456
[考博] 申博/考博 +4 啃面包的小书虫 2026-04-17 8/400 2026-04-21 16:26 by 啃面包的小书虫
[考研] 295分求调剂 +6 ?要上岸? 2026-04-17 6/300 2026-04-21 08:18 by Equinoxhua
[考研] 085600材料与化工调剂 5+3 孜孜不倦2002 2026-04-19 6/300 2026-04-20 21:25 by babero
[论文投稿] 有没有接收比较快的sci期刊呀，最好在一个月之内的，研三孩子求毕业 20+4 之护着 2026-04-16 7/350 2026-04-20 15:45 by 豆豆7758
[考研] 337求调剂 +3 jyz04 2026-04-18 3/150 2026-04-20 12:24 by 研可安
[考博] 申博 +3 Xyyx. 2026-04-18 3/150 2026-04-20 10:44 by YuY66
[考博] 湖南大学刘巧玲课题组2026年第二批次博士研究生招生信息 +3 南风观火 2026-04-18 5/250 2026-04-20 10:13 by 南风观火
[考研] 求计算机方向调剂 +3 Toffee2 2026-04-16 6/300 2026-04-19 22:37 by ll叶
[考研] 294求调剂 +8 淡然654321 2026-04-17 9/450 2026-04-19 19:51 by Equinoxhua
[考研] 304求调剂 +8 castLight 2026-04-16 8/400 2026-04-19 17:14 by 中豫男
[考研] 求调剂 +6 苦命人。。。 2026-04-18 7/350 2026-04-19 16:27 by 中豫男
[考研] 接受任何调剂 +6 也就是栗子 2026-04-17 7/350 2026-04-18 17:20 by 涵竹刘
[考研] 260求调剂 +4 Zyt1314520.. 2026-04-17 5/250 2026-04-18 08:28 by babysonlkd
[有机交流] 二苯甲酮酸类衍生物 50+3 小白爱主人 2026-04-17 6/300 2026-04-17 18:47 by kf2781974
[考研] 322求调剂 +6 tekuzu 2026-04-17 6/300 2026-04-17 13:48 by Espannnnnol
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭