应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大家帮忙分析下双向电泳结果不好的原因（有图）
121/2返回列表12下一页
查看: 3151  |  回复: 11
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

求索寻觅

金虫 (小有名气)

[求助] 大家帮忙分析下双向电泳结果不好的原因（有图）

裂解液配方是：7M尿素，2M硫尿，4%CHAPS，0.3% Bio-lyte，65 mM DTT，加入了罗氏蛋白酶抑制剂。大鼠肝脏在液氮中研磨，大约0.1 g肝脏加入了1ML裂解液，然后冰浴超声了1分钟（就是放进去超声零点几秒然后拿出1秒，再放进去，搞了1分钟）。冰上裂解1h后，35000 g离心 90 min（这个转速已经是我们实验的极限了）。吸取上清做后续实验。
    测定了蛋白浓度大概为20mg/ml，水化时吸取了100ul 加入400ul 水化缓冲液（水化缓冲液配方和裂解液一致），上样450ul进行水化，我做的是24cm的胶条，ph 3-10。我做了三根胶条，2根在水化缓冲液家了DTT，第三根加了 TBP（据说TBP可以很好的解决碱性端横纹的问题）。水化了大概14h，然后进行等点聚焦。程序如下
   100v  缓慢 1h
   200v 缓慢 1h
   500v 缓慢  1h
  1000v 缓慢 1h
10000v 线性 4h
10000v 快速 100000v.H
500 v    快速  24h
   聚焦后用的gel胶为10%的，先用50v，再用200v跑完。
    结果如下图，分别为1，2，3，左边是正极端。请大家帮忙分析下原因，不甚感激。
ps：我已经做了几个月了，结果总这样差不多烂，别人论文里面也是这样，但是图谱上蛋白点多很多，也分散的均匀，实在想不明白。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

电泳、bio-rad 电转化仪及操作

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-12-21 14:26:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

loop00

木虫 (小有名气)

阿凡达

【答案】应助回帖

真正的问题是，你的碱端聚焦不清晰，因为DTT会在电泳过程中迁移到pH7以下的位置，碱性端失去还原剂保护，无法清晰聚焦；
要解决这个问题，使用2mMTBP代替DTT（最小包装约1000元），或者在碱端加一片小滤纸，方法同‘盐桥’，并且在滤纸上额外滴DTT，我就是这么做的，碱端立刻清晰了，望采纳
赞一下(2人) 回复此楼
坚强面对生活
8楼2012-09-06 10:20:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zjkown

木虫 (初入文坛)
碱性端聚焦不好； 100000V.H 好像有点多，可以尝试缩短聚焦V.H数。（缩短后有可能会造成酸性端又聚焦不够，所以可能需要找到平衡点）。 二向可以试试4-5%的浓缩胶+10-12%的分离胶。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-12-22 06:44:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

rinp

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
求索寻觅(金币+1): 谢谢建议。我加了罗氏的蛋白酶抑制剂，是那种片剂，能抑制多种蛋白酶的。因为加了蛋白酶抑制剂，我想应该加入核酸酶也没效果了，会被抑制，你说是吗？ 2011-12-30 22:29:50
1你为什么不加蛋白酶抑制剂比如PMSF，EDTA，这可能是你蛋白损失的重要原因之一，要不就是你离心太久了，我都是20000g30min的
2 DTT有点多吧
3 为什么不加点核酸酶
4你的胶为虾米都不加marker的
赞一下 回复此楼
海到无边天做岸山登绝顶我为峰.博士学位就是鞋里的一粒米，不拿不舒服，拿了不能吃！
3楼2011-12-22 10:03:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Rubisco580

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
求索寻觅(金币+1): ★有帮助 我的IPG Buffer的配方和裂解液大致相同，就是我说的水化上样缓冲液，只是两性载体浓度有差别。您能不能具体给我说下，谢谢啊。 2011-12-30 22:32:29
1.裂解液水化液不加 IPGBuffer？
2.上样量怎么那么大？我做的时候上200~300 ug，聚焦50000Vhrs。只有质谱的时候才上这么大量聚焦100000 Vhrs。
3.胶条行不行？有时候差的胶条聚焦是会不好的。
希望有帮助
赞一下 回复此楼
4楼2011-12-22 16:35:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

求索寻觅

金虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by zjkown at 2011-12-22 06:44:19:
碱性端聚焦不好； 100000V.H 好像有点多，可以尝试缩短聚焦V.H数。（缩短后有可能会造成酸性端又聚焦不够，所以可能需要找到平衡点）。 二向可以试试4-5%的浓缩胶+10-12%的分离胶。

第二向还能再用浓缩胶吗？能不能给点这方面的资料。谢谢你的建议。
赞一下 回复此楼
5楼2011-12-30 22:27:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

求索寻觅

金虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by Rubisco580 at 2011-12-22 16:35:41:
1.裂解液水化液不加 IPGBuffer？
2.上样量怎么那么大？我做的时候上200~300 ug，聚焦50000Vhrs。只有质谱的时候才上这么大量聚焦100000 Vhrs。
3.胶条行不行？有时候差的胶条聚焦是会不好的。
希望有帮助

我是准备做好了就挖点做质谱的，所以想把量加大点。
我的胶条是今年上半年买的，一直放在-20度保存，应该没什么问题。想麻烦您具体说下IPG Buffer，因为以前我和师兄做植物蛋白的时候，提取的蛋白是固体，就是用buffer溶解，而现在我做的动物组织蛋白，蛋白样品是在裂解液里，是液体，所以buffer就是裂解液配方大致相同了。
赞一下 回复此楼
6楼2011-12-30 22:36:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

loop00

木虫 (小有名气)

阿凡达

【答案】应助回帖

其实，我想告诉你，楼上说的都不太符合你的问题哦~
赞一下 回复此楼
坚强面对生活
7楼2012-09-06 10:16:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

loop00

木虫 (小有名气)

阿凡达
因为DTT本身带负电荷，TBP也是还原保护剂，但是本身不带电，不会电泳；有钱的话还可以用烷基化试剂盒保护蛋白的巯基，有技术的话可以用IAA和DTT自己做烷基化，相当于试剂盒，哈哈哈，我觉得做了一年半双向，我真的有点懂了
赞一下 回复此楼
坚强面对生活
9楼2012-09-06 10:22:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

loop00

木虫 (小有名气)

阿凡达
再不然你试试丙酮沉淀或者CleanUp，去掉核酸、盐类、脂类的杂质
赞一下 回复此楼
坚强面对生活
10楼2012-09-06 10:29:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 求索寻觅 的主题更新
121/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 7/350 2026-08-23 03:55 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 5/250 2026-08-23 03:52 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 6/300 2026-08-23 03:40 by OEbVnUOu01ol
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-21 9/450 2026-08-23 03:31 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 QTy3jDtz1uLt 2026-08-21 9/450 2026-08-23 03:04 by OEbVnUOu01ol
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 QTy3jDtz1uLt 2026-08-21 11/550 2026-08-23 02:55 by OEbVnUOu01ol
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 DpSrDtM079iu 2026-08-22 3/150 2026-08-23 00:55 by OEbVnUOu01ol
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +3 zjuhero 2026-08-22 4/200 2026-08-22 20:02 by mycsru
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +24 yaoyewhu2008 2026-08-20 26/1300 2026-08-22 17:43 by kammury
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 放榜前的不淡定 40+4 snowwithsea 2026-08-19 14/700 2026-08-21 23:51 by cratir
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +10 kulium 2026-08-21 13/650 2026-08-21 21:58 by alongwaytogo
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +11 大萍1987 2026-08-20 13/650 2026-08-21 14:48 by 20120902066
[论文投稿] 投稿咨询 +5 wwm09 2026-08-17 7/350 2026-08-21 10:11 by 期刊论文帮手
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +10 zju2000 2026-08-16 11/550 2026-08-20 20:02 by cl479861084
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +18 基诺咪客 2026-08-17 23/1150 2026-08-20 17:19 by Godzela
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭