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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大家帮忙分析下双向电泳结果不好的原因（有图）
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求索寻觅

金虫 (小有名气)

[求助] 大家帮忙分析下双向电泳结果不好的原因（有图）

裂解液配方是：7M尿素，2M硫尿，4%CHAPS，0.3% Bio-lyte，65 mM DTT，加入了罗氏蛋白酶抑制剂。大鼠肝脏在液氮中研磨，大约0.1 g肝脏加入了1ML裂解液，然后冰浴超声了1分钟（就是放进去超声零点几秒然后拿出1秒，再放进去，搞了1分钟）。冰上裂解1h后，35000 g离心 90 min（这个转速已经是我们实验的极限了）。吸取上清做后续实验。
    测定了蛋白浓度大概为20mg/ml，水化时吸取了100ul 加入400ul 水化缓冲液（水化缓冲液配方和裂解液一致），上样450ul进行水化，我做的是24cm的胶条，ph 3-10。我做了三根胶条，2根在水化缓冲液家了DTT，第三根加了 TBP（据说TBP可以很好的解决碱性端横纹的问题）。水化了大概14h，然后进行等点聚焦。程序如下
   100v  缓慢 1h
   200v 缓慢 1h
   500v 缓慢  1h
  1000v 缓慢 1h
10000v 线性 4h
10000v 快速 100000v.H
500 v    快速  24h
   聚焦后用的gel胶为10%的，先用50v，再用200v跑完。
    结果如下图，分别为1，2，3，左边是正极端。请大家帮忙分析下原因，不甚感激。
ps：我已经做了几个月了，结果总这样差不多烂，别人论文里面也是这样，但是图谱上蛋白点多很多，也分散的均匀，实在想不明白。
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1楼 2011-12-21 14:26:53
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

loop00

木虫 (小有名气)

阿凡达

【答案】应助回帖

真正的问题是，你的碱端聚焦不清晰，因为DTT会在电泳过程中迁移到pH7以下的位置，碱性端失去还原剂保护，无法清晰聚焦；
要解决这个问题，使用2mMTBP代替DTT（最小包装约1000元），或者在碱端加一片小滤纸，方法同‘盐桥’，并且在滤纸上额外滴DTT，我就是这么做的，碱端立刻清晰了，望采纳
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坚强面对生活
8楼2012-09-06 10:20:14
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zjkown

木虫 (初入文坛)
碱性端聚焦不好； 100000V.H 好像有点多，可以尝试缩短聚焦V.H数。（缩短后有可能会造成酸性端又聚焦不够，所以可能需要找到平衡点）。 二向可以试试4-5%的浓缩胶+10-12%的分离胶。
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2楼2011-12-22 06:44:19
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普通回帖

rinp

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
求索寻觅(金币+1): 谢谢建议。我加了罗氏的蛋白酶抑制剂，是那种片剂，能抑制多种蛋白酶的。因为加了蛋白酶抑制剂，我想应该加入核酸酶也没效果了，会被抑制，你说是吗？ 2011-12-30 22:29:50
1你为什么不加蛋白酶抑制剂比如PMSF，EDTA，这可能是你蛋白损失的重要原因之一，要不就是你离心太久了，我都是20000g30min的
2 DTT有点多吧
3 为什么不加点核酸酶
4你的胶为虾米都不加marker的
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海到无边天做岸山登绝顶我为峰.博士学位就是鞋里的一粒米，不拿不舒服，拿了不能吃！
3楼2011-12-22 10:03:59
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Rubisco580

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
求索寻觅(金币+1): ★有帮助 我的IPG Buffer的配方和裂解液大致相同，就是我说的水化上样缓冲液，只是两性载体浓度有差别。您能不能具体给我说下，谢谢啊。 2011-12-30 22:32:29
1.裂解液水化液不加 IPGBuffer？
2.上样量怎么那么大？我做的时候上200~300 ug，聚焦50000Vhrs。只有质谱的时候才上这么大量聚焦100000 Vhrs。
3.胶条行不行？有时候差的胶条聚焦是会不好的。
希望有帮助
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4楼2011-12-22 16:35:41
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求索寻觅

金虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by zjkown at 2011-12-22 06:44:19:
碱性端聚焦不好； 100000V.H 好像有点多，可以尝试缩短聚焦V.H数。（缩短后有可能会造成酸性端又聚焦不够，所以可能需要找到平衡点）。 二向可以试试4-5%的浓缩胶+10-12%的分离胶。

第二向还能再用浓缩胶吗？能不能给点这方面的资料。谢谢你的建议。
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5楼2011-12-30 22:27:46
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求索寻觅

金虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by Rubisco580 at 2011-12-22 16:35:41:
1.裂解液水化液不加 IPGBuffer？
2.上样量怎么那么大？我做的时候上200~300 ug，聚焦50000Vhrs。只有质谱的时候才上这么大量聚焦100000 Vhrs。
3.胶条行不行？有时候差的胶条聚焦是会不好的。
希望有帮助

我是准备做好了就挖点做质谱的，所以想把量加大点。
我的胶条是今年上半年买的，一直放在-20度保存，应该没什么问题。想麻烦您具体说下IPG Buffer，因为以前我和师兄做植物蛋白的时候，提取的蛋白是固体，就是用buffer溶解，而现在我做的动物组织蛋白，蛋白样品是在裂解液里，是液体，所以buffer就是裂解液配方大致相同了。
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6楼2011-12-30 22:36:42
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loop00

木虫 (小有名气)

阿凡达

【答案】应助回帖

其实，我想告诉你，楼上说的都不太符合你的问题哦~
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坚强面对生活
7楼2012-09-06 10:16:35
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loop00

木虫 (小有名气)

阿凡达
因为DTT本身带负电荷，TBP也是还原保护剂，但是本身不带电，不会电泳；有钱的话还可以用烷基化试剂盒保护蛋白的巯基，有技术的话可以用IAA和DTT自己做烷基化，相当于试剂盒，哈哈哈，我觉得做了一年半双向，我真的有点懂了
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坚强面对生活
9楼2012-09-06 10:22:29
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loop00

木虫 (小有名气)

阿凡达
再不然你试试丙酮沉淀或者CleanUp，去掉核酸、盐类、脂类的杂质
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坚强面对生活
10楼2012-09-06 10:29:04
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