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求如何反转录3-4k的大片段
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求指教！！！ 我做的是CPV病毒，其基因组为dsRNA，所以要反转录才可以拿到dsDNA。因为其基因组很特殊，为10个大小不一的dsRNA片段，所以只要将基因组跑电泳然后割胶回收就可拿到某一特定的dsRNA片段，然后做反转录。但是因为片段太长（分别为3.2k 4.3k.4.8k），总是出来一个1.5k的片段。然后认为问题出在模板浓度太低，所以将CPV病毒感染宿主，然后提取总RNA，其中亦必然包含大量的病毒mRNA，然后再反转录，还是不成功。但是若是分段克隆的话（在基因序列中间设计引物，上下游各2k的片段分别克隆），即还是以上述病毒感染宿主后提取的总RNA为模板，就能克隆到特异性很好的片段。但是没法将两个片段连接起来，所以求能够一次性将3k以上片段克隆出来的方法。 多谢！！！ |
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blackrose8089
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2楼2011-11-24 19:32:09
