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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求如何反转录3-4k的大片段
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yrslam

铁虫 (小有名气)

[求助] 求如何反转录3-4k的大片段

求指教！！！
我做的是CPV病毒，其基因组为dsRNA，所以要反转录才可以拿到dsDNA。因为其基因组很特殊，为10个大小不一的dsRNA片段，所以只要将基因组跑电泳然后割胶回收就可拿到某一特定的dsRNA片段，然后做反转录。但是因为片段太长（分别为3.2k 4.3k.4.8k），总是出来一个1.5k的片段。然后认为问题出在模板浓度太低，所以将CPV病毒感染宿主，然后提取总RNA，其中亦必然包含大量的病毒mRNA，然后再反转录，还是不成功。但是若是分段克隆的话（在基因序列中间设计引物，上下游各2k的片段分别克隆），即还是以上述病毒感染宿主后提取的总RNA为模板，就能克隆到特异性很好的片段。但是没法将两个片段连接起来，所以求能够一次性将3k以上片段克隆出来的方法。
多谢！！！
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1楼 2011-11-24 19:28:36
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励应助！ 2011-11-24 21:53:51
楼主能不能设计引物使反转录的片段之间有段重叠序列，然后再做overlapping PCR
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jiayoubashaonian
2楼2011-11-24 19:32:09
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