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zhangqian082

新虫 (小有名气)

[求助] PCR没有条带,求高人指点!!!!!!!!!

最近在扩增两个基因,含有酶切位点和保护碱基,片段长度和引物分别如下:

1)目的基因长度1401bp
上游引物:atg ctc gag gac acc aaa cat ttc ctg ccg ctc gat
下游引物:atg aag ctt atg ggc ccg cag gcc taa gtc att tg

2)目的基因长度1600bp
上游引物:atg ctc gag tct tgg gcc gct cgc ccg ccc tt
下游引物:atg aag ctt ggt ctg agc tca ggc cag ttg

使用的是TAKARA 的Mix 酶,使用20微升的体系如下:
Premix:10微升
CDNA:2微升
Primer1:0.4微升
Primer2:0.4微升
水:7.2微升

模板是RT反转录的来的CDNA。

看引物的GC含量较高,就设了温度梯度,60-70°,但是始终都没有条带。
现在要每天看老板脸色了,呜呜,请高人指点下,多谢!
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
wanhscn(金币+4): good!对楼主有帮助! 2011-11-11 11:57:56
楼主的cDNA片段是不是没有得到全长的序列。建议楼主设计特异性引物分段反转录,两端反转录的片段设置重叠区,再用特异性引物扩增后融合到一块,我们做的物种GC含量平均到66%,短的1k左右的反转录一次性完成,长些的分段反转录,我觉得楼主的PCR温度是没问题的,问题可能在cDNA模板上,供楼主参考!
jiayoubashaonian
2楼2011-11-11 10:55:26
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zhangqian082

新虫 (小有名气)

多谢!
3楼2011-11-11 13:05:24
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