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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR没有条带，求高人指点！！！！！！！！！
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zhangqian082

新虫 (小有名气)

[求助] PCR没有条带，求高人指点！！！！！！！！！

最近在扩增两个基因，含有酶切位点和保护碱基，片段长度和引物分别如下：

1）目的基因长度1401bp
上游引物：atg ctc gag gac acc aaa cat ttc ctg ccg ctc gat
下游引物：atg aag ctt atg ggc ccg cag gcc taa gtc att tg

2）目的基因长度1600bp
上游引物：atg ctc gag tct tgg gcc gct cgc ccg ccc tt
下游引物：atg aag ctt ggt ctg agc tca ggc cag ttg

使用的是TAKARA 的Mix 酶，使用20微升的体系如下：
Premix:10微升
CDNA：2微升
Primer1:0.4微升
Primer2:0.4微升
水：7.2微升

模板是RT反转录的来的CDNA。

看引物的GC含量较高，就设了温度梯度，60-70°，但是始终都没有条带。
现在要每天看老板脸色了，呜呜，请高人指点下，多谢！
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1楼 2011-11-11 10:22:09
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
wanhscn(金币+4): good!对楼主有帮助! 2011-11-11 11:57:56
楼主的cDNA片段是不是没有得到全长的序列。建议楼主设计特异性引物分段反转录，两端反转录的片段设置重叠区，再用特异性引物扩增后融合到一块，我们做的物种GC含量平均到66%，短的1k左右的反转录一次性完成，长些的分段反转录，我觉得楼主的PCR温度是没问题的，问题可能在cDNA模板上，供楼主参考！
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jiayoubashaonian
2楼2011-11-11 10:55:26
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zhangqian082

新虫 (小有名气)
多谢！
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3楼2011-11-11 13:05:24
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