24小时热门版块排行榜    

查看: 1202  |  回复: 11

木左左

银虫 (正式写手)

[求助] PCR成这样,求助!!!

公司做的cDNA,引物,然后是体系,程序自己做的,cDNA公司有没有用内参检测我也不清楚,电泳图下面有,引物一的Tm值64.13,二的Tm值63.95,目的片段GC含量高可以到60%,目的片段出多2300多bp,体系:buffer2.5mg2.0dntp2.0引物0.5酶0.3cDNA1.5和0.5两个,程序95度10分钟,94度45秒,63.5度45秒,72度90秒,15个循环;94度45秒,58.5度45秒72度45秒20个循环,72度10分钟。大家给建议,看看我怎么修改体系和程序,才能有可能扩出目的片段!谢谢

2000马克
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

木左左

银虫 (正式写手)

还麻烦大家给我分析下我的图
2楼2011-10-21 11:07:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2): 感谢交流! 2011-10-23 15:13:16
木左左(金币+1): 2011-11-12 22:40:39
72℃,2 min。不能少于1.5 min。
退火30 s就够了。
3楼2011-10-21 22:48:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

木左左

银虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2011-10-21 22:48:54:
72℃,2 min。不能少于1.5 min。
退火30 s就够了。

谢谢啊
4楼2011-10-22 10:35:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

木左左

银虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2011-10-21 22:48:54:
72℃,2 min。不能少于1.5 min。
退火30 s就够了。

你说的72度2min是指延伸时还是指最后一步啊!
5楼2011-10-22 12:02:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

doublehelix

木虫 (著名写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 木左左 at 2011-10-22 12:02:19:
你说的72度2min是指延伸时还是指最后一步啊!

延伸
6楼2011-10-22 12:19:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

丙氨酸密码子

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2): 鼓励交流! 2011-10-23 15:13:47
木左左(金币+2): 2011-11-12 22:40:54
你片段这么大,延伸时间太短了。一般情况是1kb/1min,你把延伸时间提到2min30s看看,还有你这个退火温度我觉得57应该可以吧,我有对引物Tm值是66,我59度P出来的。
程序:95度 4min
(94度 40s,57度 50s ,72度 2min30s)35cycle
最后总延伸 72度 10min
你试试看可行。
7楼2011-10-22 12:51:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

木左左

银虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 丙氨酸密码子 at 2011-10-22 12:51:26:
你片段这么大,延伸时间太短了。一般情况是1kb/1min,你把延伸时间提到2min30s看看,还有你这个退火温度我觉得57应该可以吧,我有对引物Tm值是66,我59度P出来的。
程序:95度 4min
(94度 40s,57度 50s ,72度 ...

谢谢
8楼2011-10-22 15:49:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hausippe

禁虫 (著名写手)

★ ★
adslye(金币+2): 说明下原理可能更好,谢谢交流! 2011-10-23 15:14:11
本帖内容被屏蔽

9楼2011-10-22 21:40:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuzhiming

捐助贵宾 (知名作家)

【答案】应助回帖

木左左(金币+2): 2011-11-12 22:41:30
模板确定没有问题?
那就换家PCR聚合酶试试。 TAKARA公司,NEB公司等知名常用公司的产品。
GC含量高,如果真的会影响你的PCR效率,找TAKARA公司订购GC-buffer及LA Taq酶。如果再批不出来。十有八九就是你的模板的问题了。

你的电泳图片感觉拍的很不清晰。是你们的的凝胶成像仪不好,还是你跑的电泳效果太差?而且Marker条件也不是很好看。
10楼2011-11-02 15:38:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 木左左 的主题更新
信息提示
请填处理意见