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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR成这样，求助！！！
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木左左

银虫 (正式写手)

[求助] PCR成这样，求助！！！

公司做的cDNA，引物，然后是体系，程序自己做的，cDNA公司有没有用内参检测我也不清楚，电泳图下面有，引物一的Tm值64.13，二的Tm值63.95，目的片段GC含量高可以到60%，目的片段出多2300多bp，体系：buffer2.5mg2.0dntp2.0引物0.5酶0.3cDNA1.5和0.5两个，程序95度10分钟，94度45秒，63.5度45秒，72度90秒，15个循环；94度45秒，58.5度45秒72度45秒20个循环，72度10分钟。大家给建议，看看我怎么修改体系和程序，才能有可能扩出目的片段！谢谢

2000马克
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1楼 2011-10-21 11:06:42
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木左左

银虫 (正式写手)
还麻烦大家给我分析下我的图
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2楼2011-10-21 11:07:27
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2): 感谢交流！ 2011-10-23 15:13:16
木左左(金币+1): 2011-11-12 22:40:39
72℃，2 min。不能少于1.5 min。
退火30 s就够了。
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3楼2011-10-21 22:48:54
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木左左

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2011-10-21 22:48:54:
72℃，2 min。不能少于1.5 min。
退火30 s就够了。

谢谢啊
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4楼2011-10-22 10:35:05
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木左左

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2011-10-21 22:48:54:
72℃，2 min。不能少于1.5 min。
退火30 s就够了。

你说的72度2min是指延伸时还是指最后一步啊！
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5楼2011-10-22 12:02:19
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doublehelix

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 木左左 at 2011-10-22 12:02:19:
你说的72度2min是指延伸时还是指最后一步啊！

延伸
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6楼2011-10-22 12:19:11
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丙氨酸密码子

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2): 鼓励交流！ 2011-10-23 15:13:47
木左左(金币+2): 2011-11-12 22:40:54
你片段这么大，延伸时间太短了。一般情况是1kb/1min，你把延伸时间提到2min30s看看，还有你这个退火温度我觉得57应该可以吧，我有对引物Tm值是66，我59度P出来的。
程序：95度 4min
（94度 40s，57度 50s ，72度 2min30s）35cycle
最后总延伸 72度 10min
你试试看可行。
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7楼2011-10-22 12:51:26
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木左左

银虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 丙氨酸密码子 at 2011-10-22 12:51:26:
你片段这么大，延伸时间太短了。一般情况是1kb/1min，你把延伸时间提到2min30s看看，还有你这个退火温度我觉得57应该可以吧，我有对引物Tm值是66，我59度P出来的。
程序：95度 4min
（94度 40s，57度 50s ，72度 ...

谢谢
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8楼2011-10-22 15:49:53
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hausippe

禁虫 (著名写手)
★ ★
adslye(金币+2): 说明下原理可能更好，谢谢交流！ 2011-10-23 15:14:11
本帖内容被屏蔽
9楼2011-10-22 21:40:47
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yuzhiming

捐助贵宾 (知名作家)

【答案】应助回帖

木左左(金币+2): 2011-11-12 22:41:30
模板确定没有问题？
那就换家PCR聚合酶试试。 TAKARA公司，NEB公司等知名常用公司的产品。
GC含量高，如果真的会影响你的PCR效率，找TAKARA公司订购GC-buffer及LA Taq酶。如果再批不出来。十有八九就是你的模板的问题了。

你的电泳图片感觉拍的很不清晰。是你们的的凝胶成像仪不好，还是你跑的电泳效果太差？而且Marker条件也不是很好看。
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10楼2011-11-02 15:38:20
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