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木左左

银虫 (正式写手)

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专业: 基因表达调控与表观遗传学

[求助] PCR成这样，求助！！！

公司做的cDNA，引物，然后是体系，程序自己做的，cDNA公司有没有用内参检测我也不清楚，电泳图下面有，引物一的Tm值64.13，二的Tm值63.95，目的片段GC含量高可以到60%，目的片段出多2300多bp，体系：buffer2.5mg2.0dntp2.0引物0.5酶0.3cDNA1.5和0.5两个，程序95度10分钟，94度45秒，63.5度45秒，72度90秒，15个循环；94度45秒，58.5度45秒72度45秒20个循环，72度10分钟。大家给建议，看看我怎么修改体系和程序，才能有可能扩出目的片段！谢谢

2000马克

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1楼 2011-10-21 11:06:42

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丙氨酸密码子

新虫 (小有名气)

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专业: 生物化学

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2): 鼓励交流！ 2011-10-23 15:13:47
木左左(金币+2): 2011-11-12 22:40:54

你片段这么大，延伸时间太短了。一般情况是1kb/1min，你把延伸时间提到2min30s看看，还有你这个退火温度我觉得57应该可以吧，我有对引物Tm值是66，我59度P出来的。
程序：95度 4min
（94度 40s，57度 50s ，72度 2min30s）35cycle
最后总延伸 72度 10min
你试试看可行。