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木左左

银虫 (正式写手)

[求助] PCR成这样,求助!!!

公司做的cDNA,引物,然后是体系,程序自己做的,cDNA公司有没有用内参检测我也不清楚,电泳图下面有,引物一的Tm值64.13,二的Tm值63.95,目的片段GC含量高可以到60%,目的片段出多2300多bp,体系:buffer2.5mg2.0dntp2.0引物0.5酶0.3cDNA1.5和0.5两个,程序95度10分钟,94度45秒,63.5度45秒,72度90秒,15个循环;94度45秒,58.5度45秒72度45秒20个循环,72度10分钟。大家给建议,看看我怎么修改体系和程序,才能有可能扩出目的片段!谢谢

2000马克
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木左左

银虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 丙氨酸密码子 at 2011-10-22 12:51:26:
你片段这么大,延伸时间太短了。一般情况是1kb/1min,你把延伸时间提到2min30s看看,还有你这个退火温度我觉得57应该可以吧,我有对引物Tm值是66,我59度P出来的。
程序:95度 4min
(94度 40s,57度 50s ,72度 ...

谢谢
8楼2011-10-22 15:49:53
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木左左

银虫 (正式写手)

还麻烦大家给我分析下我的图
2楼2011-10-21 11:07:27
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2): 感谢交流! 2011-10-23 15:13:16
木左左(金币+1): 2011-11-12 22:40:39
72℃,2 min。不能少于1.5 min。
退火30 s就够了。
3楼2011-10-21 22:48:54
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木左左

银虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2011-10-21 22:48:54:
72℃,2 min。不能少于1.5 min。
退火30 s就够了。

谢谢啊
4楼2011-10-22 10:35:05
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