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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 3301质粒 用EcoI 和HandⅢ 无法酶切
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tanxi125

银虫 (小有名气)

[求助] 3301质粒 用EcoI 和HandⅢ 无法酶切

3301质粒 用EcoI 和HandⅢ 无法酶切
用的是两个酶的通用buffer  R
  体系是20μl 体系

ddH2O            12μl
10×buffer R    2μl
质粒           4μl
EcoI                    1μl
HandⅢ       1μl
37℃过夜
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什么都得靠自己！我现在深刻理解！
1楼 2011-10-17 21:12:13
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amilie030312

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

话说你这两个位点选的中间保护碱基不足，同时双切能切好的可能性不大。能换位点最好，实在不能换就先切后面的那个，再切前面的，可能会好些，但后切的那个肯定会由于保护碱基不足切的不是特别好。
顺便问一句，酶切为啥要过夜啊，线性化片段最多半个小时，质粒一个小时也够了，切那么久干嘛。
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7楼2011-10-20 12:43:34
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doublehelix

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

tanxi125(金币+2): 2011-11-30 19:42:20
37度过夜这个时间太长，可试一下16度过夜
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2楼2011-10-18 10:08:13
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tanxi125

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by doublehelix at 2011-10-18 10:08:13:
37度过夜这个时间太长，可试一下16度过夜

时间长 难道不就酶切的更加完全吗
赞一下 回复此楼
什么都得靠自己！我现在深刻理解！
3楼2011-10-18 12:03:05
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doublehelix

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
lstt09nk(金币+3): 鼓励交流，欢迎常来 2011-10-18 16:30:57
引用回帖:
3楼: Originally posted by tanxi125 at 2011-10-18 12:03:05:
时间长 难道不就酶切的更加完全吗

时间长 当然能酶切的更加完全，关键是你时间太长，有可能全部切烂了，提出的问题没说是切不开还是其它状况，但这么长的时间肯定是有问题的，另外 ，如果你用双酶切质粒切不开，那你可以分别试一下单切 效果，按理说这两个酶双切用通用buffer很好切才对的呀，我们常用，效果不错的呀，，，如果你单切不开，那可能就是酶有问题了，可考虑换支新酶试试
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4楼2011-10-18 12:09:18
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