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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助16sv3区结果分析
汕头大学海洋科学接受调剂
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thestormcong

银虫 (小有名气)

[交流] 求助16sv3区结果分析 已有8人参与

这是本人的16sv3区扩增产物，模板为16spcr全序列，引物为v3区通用引物，结果显示该区很宽，是不是有非特异性扩增，能否直接进行下一步的DGGE，请教各位能够指点，非常感谢！
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1楼 2011-10-07 22:18:04
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

红多多

木虫 (正式写手)

版筑饭牛的日子
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1949stone(MolEPI+1): 鼓励 2011-10-07 23:27:25
建议你用QIAGEN的盒子，这个贵点，但是考虑到你对细菌定量的准确性这个绝对物有所值！另外你如果16s出来的结果是单一条带，那理论上出来的出来的应该是单一条带。但是也不排除多种条带的可能。你这个多做几遍试试把。不行的话就整个上胶。不过这个和DGGE的功能优势貌似有点不符~~
另外说点个人的看法啊，你用基因组扩增16S全长，在这个过程中其实原始细菌的量反应在你PCR结果上应该就不准了，因为通用引物对每种细菌16S的扩增效率是不一样的，这样出来的结果本来就不准确了，然后你在用这个不准的结果再次用DGGE引物扩增，这个貌似就更不靠谱了。所以我个人认为这样做欠妥。个人看法，仅供参考哈。
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可以用QQ找我……
6楼2011-10-07 23:13:17
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红多多

木虫 (正式写手)

版筑饭牛的日子
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西瓜(金币+3): 好东西 2011-10-10 17:26:45
引用回帖:
12楼: Originally posted by star-smile at 2011-10-08 20:55:27:
可否帮忙查阅一下？多谢……

发你个入门级的文献把，看了这个以后你会少很多问题的 嘿嘿。
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可以用QQ找我……
13楼2011-10-09 10:22:29
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普通回帖

红多多

木虫 (正式写手)

版筑饭牛的日子
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西瓜(金币+1): 鼓励 2011-10-10 17:26:07
我们实验室做DGGE第一步PCR出来的结果是非常单一的一条带，你这个貌似是不可以直接上胶的。引物应该都是现成的，你模版用的是什么地方提取出来的菌啊，总DNA可能提的不是很好。还有你这个貌似是用自己的相机在紫外板上照的把，这样的图投文章别人不认的……
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2楼2011-10-07 22:28:51
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thestormcong

银虫 (小有名气)
非常感谢您的指点！我这个土壤是一位留学生从外国带来的，土壤DNA提取用的是生工的柱式提取试剂盒，该图的确是用自己相机拍的。那请问您我是需要重新提取基因组吗？是不是基因组的16sV3区扩增出来都是很单一的条带啊，我这个又是什么原因呢。另外该V3pcr产物的模板是16s全序列，16s全序列pcr结果条带还是比较单一的呢。直接拿基因组当模板扩v3区没能扩增出来。
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3楼2011-10-07 22:41:14
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thestormcong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
1楼: Originally posted by thestormcong at 2011-10-07 22:18:04:
这是本人的16sv3区扩增产物，模板为16spcr全序列，引物为v3区通用引物，结果显示该区很宽，是不是有非特异性扩增，能否直接进行下一步的DGGE，请教各位能够指点，非常感谢！
[eimg]20/11/1410070_1317996763_705. ...

非常感谢您的指点！我这个土壤是一位留学生从外国带来的，土壤DNA提取用的是生工的柱式提取试剂盒，该图的确是用自己相机拍的。那请问您我是需要重新提取基因组吗？是不是基因组的16sV3区扩增出来都是很单一的条带啊，我这个又是什么原因呢。另外该V3pcr产物的模板是16s全序列，16s全序列pcr结果条带还是比较单一的呢。直接拿基因组当模板扩v3区没能扩增出来。
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4楼2011-10-07 22:43:02
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runrain

金虫 (小有名气)
★
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V3区的片段大小在300bp左右，你这个位置是大约300左右吗？？
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5楼2011-10-07 23:07:08
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thestormcong

银虫 (小有名气)
非常感谢您提出来的意见，我再接着尝试看看，还有你的个人看法，我也还需要看看更多的文献了解了解，下次再交流！
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7楼2011-10-07 23:26:28
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star-smile

铁虫 (初入文坛)
★
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可能是你的16s产物需要稀释一下，那样扩展出的V3区的条带应该会单一……
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8楼2011-10-08 09:19:55
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star-smile

铁虫 (初入文坛)
可否再请教一个问题，再请教一个问题：做那个凝胶时候，你的那个gel高浓度是用的70%，低的用的45%，对吗？我再想问一下，那个高浓度gel中Acrylamide/Bis的浓度是多大的呢？低的gel中Acrylamide/Bis的浓度是多大呢？多谢
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9楼2011-10-08 09:21:48
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红多多

木虫 (正式写手)

版筑饭牛的日子
★
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我们实验室用的现成的胶条溶解的，具体浓度我也不知道^
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10楼2011-10-08 10:01:37
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