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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 相对定量PCR求助
汕头大学海洋科学接受调剂
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物质鉴定

金虫 (正式写手)

[求助] 相对定量PCR求助 已有2人参与

本人刚接触分子，想请教各位牛人有关实时定量荧光PCR的一些问题。我要做不同土壤位点某类微生物的相对量的多少，所以想做相对定量PCR，初步的实验思路如下：
1提取各位点土壤中的DNA。
2实时荧光PCR。将某位点的DNA连续稀释7个10倍梯度，设定DNA的终拷贝数分别为100-10-7n/ul，用来做相对定量的标曲
3.已知这类微生物的特征基因A,用A基因扩增引物扩增上步中不同稀释倍数DNA中的A基因及其他位点样品的A基因。设定阈值，通过Ct值计算出各位点中A基因模板的相对拷贝数，从而得出各位点某类微生物的相对多少
不知道我的想法是不是对的？请各位指教，我会虚心接受大家的意见。另外我看好多有要管家基因，我这里需要管家基因嘛？
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1楼 2011-10-01 13:40:52
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于清
2楼2011-10-01 15:44:44
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wqj1988926

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

物质鉴定(金币+5): 2011-10-04 13:03:55
楼主想用的是什么方法，相对定量还是绝对定量，
相对定量的话看家基因是一定要的，楼主的第二部的母的就是筛选最适模板浓度，即pcr效率较为接近100%
绝对定量不需要看家基因，需要做标准曲线，通过标准曲线来定量，但是标准品难以获得，自己做的不一定符合要求，所以一般不采用这种方法。
一点浅见，希望对你有用。
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风雪夜归人
3楼2011-10-02 19:26:54
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xinongfish

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

你做微生物含量的多少，完全可以用DGGE啊，RT-PCR主要是看基因表达量的差异的，例如不同处理条件下，二者的表达量差异
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4楼2011-10-03 10:29:36
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物质鉴定

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wqj1988926 at 2011-10-02 19:26:54:
楼主想用的是什么方法，相对定量还是绝对定量，
相对定量的话看家基因是一定要的，楼主的第二部的母的就是筛选最适模板浓度，即pcr效率较为接近100%
绝对定量不需要看家基因，需要做标准曲线，通过标准曲线来定 ...

作微生物的话用什么看家基因好列，能给点意见吗？谢谢
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5楼2011-10-04 12:57:15
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物质鉴定

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xinongfish at 2011-10-03 10:29:36:
你做微生物含量的多少，完全可以用DGGE啊，RT-PCR主要是看基因表达量的差异的，例如不同处理条件下，二者的表达量差异

老板说DGGE已经过时了，所以不要我做，呵呵
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6楼2011-10-04 13:04:31
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wubingqi

木虫 (小有名气)
你是想知道那种微生物的多少啊，细菌？真菌？
是要土壤中总的微生物量的多少，还是土壤中某种微生物占的比比例的多少？
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7楼2011-10-04 14:09:56
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xinongfish

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 物质鉴定 at 2011-10-04 12:57:15:
作微生物的话用什么看家基因好列，能给点意见吗？谢谢

是不是啊，我还打算做呢 O(∩_∩)O~
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8楼2011-10-04 23:12:59
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默默的等待

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我感觉你用探针做是不是好一点啊 自己觉得，不知道对不对
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9楼2011-10-05 21:48:11
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xiajiao1012

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2143191楼: Originally posted by 物质鉴定 at 2011-10-04 12:57:15
作微生物的话用什么看家基因好列，能给点意见吗？谢谢...

你现在应该已经确定方法做了吧。我也想请教一下呢，我是做混合菌种某种微生物的计数，想请你分享下经验，不胜感激~~
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just be happy
10楼2012-11-01 09:29:14
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