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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 碱裂解法提质粒之怪现象
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tianhuijuan

金虫 (小有名气)

[交流] 碱裂解法提质粒之怪现象

如题，最近一直在做克隆，质粒提取经常出现同样的问题：同样的实验操作，之前有提取出来，最近几次都是失败，电泳检测无条带出现，其中有时会有RNase消化后浑浊，离心有不溶物的现象。用了鼎国质粒快速提取试剂盒提取，同样无结果，师姐说是不是实验室摇床出问题了... 虫友们帮忙支支招，谢谢啦~
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1楼2011-09-26 16:10:00
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nnxqwei

至尊木虫 (职业作家)
★ ★
tianhuijuan(金币+10): 2011-09-26 18:24:12
adslye(金币+2): 鼓励交流~国庆快乐~ 2011-09-30 16:52:34
1.首先确定你培养的菌有没有问题，确定它还有质粒吗？
2.试剂盒各溶液确定没有问题吗？
3.操作过程有没有出问题？
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2楼2011-09-26 18:01:36
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tianhuijuan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by nnxqwei at 2011-09-26 18:01:36:
1.首先确定你培养的菌有没有问题，确定它还有质粒吗？
2.试剂盒各溶液确定没有问题吗？
3.操作过程有没有出问题？

首先谢谢你的意见。我培养的菌是实验室冻存的，没问题，之前提出来过，同时新转化了一批同样的质粒，提质粒也没结果，因该不是菌的问题；试剂盒也是先前用过的，可能会过期，但是与手提结果一样，估计也没问题吧；操作过程已经很是注意了，每一步都很小心的，实在想不出哪里的原因了..
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3楼2011-09-26 18:23:58
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nnxqwei

至尊木虫 (职业作家)
★ ★
adslye(金币+2): 很热心~ 2011-09-30 16:53:06
1.质粒有多大，它的拷贝数大吗？它在宿主中稳定吗？
2.如果质粒在宿主是稳定存在，不可能提不出来吧。。。
3.“操作过程已经很是注意了，每一步都很小心的”如果你的洗液用久了，又没盖好的话，乙醇挥发了，是提不出质粒的。。。
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4楼2011-09-26 18:47:41
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tianhuijuan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by nnxqwei at 2011-09-26 18:47:41:
1.质粒有多大，它的拷贝数大吗？它在宿主中稳定吗？
2.如果质粒在宿主是稳定存在，不可能提不出来吧。。。
3.“操作过程已经很是注意了，每一步都很小心的”如果你的洗液用久了，又没盖好的话，乙醇挥发了，是提 ...

所用质粒是实验室里常用的pGEX-5x-1，大肠杆菌宿主细胞，这麽多年了就没出过问题的。碱裂解法提质粒所用的溶液1,3配了储存液，每次用的时候取适量高压灭菌的，溶液2、70%乙醇每次都现配，NaAc也是用-20度的储存液.你的意思不是配培养条件的影响？
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5楼2011-09-26 18:56:55
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nnxqwei

至尊木虫 (职业作家)
以上你说的溶液和操作没问题的话，可能培养出问题，质粒不稳定存在了吧
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6楼2011-09-26 19:08:01
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tianhuijuan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by nnxqwei at 2011-09-26 19:08:01:
以上你说的溶液和操作没问题的话，可能培养出问题，质粒不稳定存在了吧

今天换个水浴摇床试一下，但愿能找到原因。多谢帮助。
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7楼2011-09-26 19:24:51
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linyingjia

至尊木虫 (职业作家)
试剂盒应该没问题    可能还是手法上的事
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8楼2011-09-27 09:52:54
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tianhuijuan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by linyingjia at 2011-09-27 09:52:54:
试剂盒应该没问题    可能还是手法上的事

经典的几个步骤，之前提出来过的，再不行就换个人试一下。多谢版主。
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9楼2011-09-27 10:34:17
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tianhuijuan

金虫 (小有名气)
后续试验证明：培养没问题；所有用到溶液重新配置提取出来了。不过还是纠结：储存液怎麽就不行了，在冰箱放置时间又不长，看来以后不能再嫌麻烦了。
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10楼2011-09-28 14:26:02
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tdhslxiaoyao

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
有可能是菌体培养时间过长了，看看菌液是否有浑浊体。另外也跟操作技术不稳定有关，祝你好运
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11楼2011-09-30 15:34:14
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adslye

银虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
A.花点时间设计阴阳性对照排除各种可能，比如：
1.找一个实验室别人的菌，肯定有质粒的。用现有试剂提一遍。排除：试剂和手法问题。
2.如果1中提出来了，说明是菌的问题。
  2.1还有没有保种的菌？有的话，拿来摇起来，提一下。
  2.2用别的保种的菌做阳性对照，与自己的菌一起摇，排除培养问题。
等等，做一个系统的规划，就不会乱了。

B.提质粒出问题，好久没见过了。没必要为这种实验浪费时间。
有个快捷方法：请隔壁实验室的MM吃顿饭，让她用她的试剂帮你提一遍。
如果提不出，基本确定是菌的问题了，估计还是很严重的问题。

祝好运，十一快乐。
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12楼2011-09-30 17:04:51
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tianhuijuan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by adslye at 2011-09-30 17:04:51:
A.花点时间设计阴阳性对照排除各种可能，比如：
1.找一个实验室别人的菌，肯定有质粒的。用现有试剂提一遍。排除：试剂和手法问题。
2.如果1中提出来了，说明是菌的问题。
  2.1还有没有保种的菌？有的话，拿来 ...

多谢版主高见！
也祝十一快乐哈！
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13楼2011-09-30 18:53:08
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tianhuijuan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by tdhslxiaoyao at 2011-09-30 15:34:14:
有可能是菌体培养时间过长了，看看菌液是否有浑浊体。另外也跟操作技术不稳定有关，祝你好运

培养时间关系不大吧，一般16小时以内，细菌应该不崩溃死亡导致质粒丢失的。操作技术确实是个问题，有待提高。
多谢帮助回帖。
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14楼2011-09-30 18:58:19
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花花贝

金虫 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
我们用TAKARA或OMEGA试剂盒，屡试不爽。一般就是提取液的问题，建议试剂盒提取。
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tianhuijuan
15楼2011-10-03 19:21:07
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tianhuijuan

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
15楼: Originally posted by 花花贝 at 2011-10-03 19:21:07:
我们用TAKARA或OMEGA试剂盒，屡试不爽。一般就是提取液的问题，建议试剂盒提取。

实验室一直有勤俭节约的优良作风与传统，手提费时，效果还行.呵呵
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16楼2011-10-03 21:36:43
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WQS1991

银虫 (正式写手)
学习了
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17楼2014-08-21 13:04:13
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