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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 碱裂解法提质粒之怪现象
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tianhuijuan

金虫 (小有名气)

[交流] 碱裂解法提质粒之怪现象

如题，最近一直在做克隆，质粒提取经常出现同样的问题：同样的实验操作，之前有提取出来，最近几次都是失败，电泳检测无条带出现，其中有时会有RNase消化后浑浊，离心有不溶物的现象。用了鼎国质粒快速提取试剂盒提取，同样无结果，师姐说是不是实验室摇床出问题了... 虫友们帮忙支支招，谢谢啦~
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1楼2011-09-26 16:10:00
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tianhuijuan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by nnxqwei at 2011-09-26 18:01:36:
1.首先确定你培养的菌有没有问题，确定它还有质粒吗？
2.试剂盒各溶液确定没有问题吗？
3.操作过程有没有出问题？

首先谢谢你的意见。我培养的菌是实验室冻存的，没问题，之前提出来过，同时新转化了一批同样的质粒，提质粒也没结果，因该不是菌的问题；试剂盒也是先前用过的，可能会过期，但是与手提结果一样，估计也没问题吧；操作过程已经很是注意了，每一步都很小心的，实在想不出哪里的原因了..
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3楼2011-09-26 18:23:58
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nnxqwei

至尊木虫 (职业作家)
★ ★
tianhuijuan(金币+10): 2011-09-26 18:24:12
adslye(金币+2): 鼓励交流~国庆快乐~ 2011-09-30 16:52:34
1.首先确定你培养的菌有没有问题，确定它还有质粒吗？
2.试剂盒各溶液确定没有问题吗？
3.操作过程有没有出问题？
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2楼2011-09-26 18:01:36
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nnxqwei

至尊木虫 (职业作家)
★ ★
adslye(金币+2): 很热心~ 2011-09-30 16:53:06
1.质粒有多大，它的拷贝数大吗？它在宿主中稳定吗？
2.如果质粒在宿主是稳定存在，不可能提不出来吧。。。
3.“操作过程已经很是注意了，每一步都很小心的”如果你的洗液用久了，又没盖好的话，乙醇挥发了，是提不出质粒的。。。
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4楼2011-09-26 18:47:41
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tianhuijuan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by nnxqwei at 2011-09-26 18:47:41:
1.质粒有多大，它的拷贝数大吗？它在宿主中稳定吗？
2.如果质粒在宿主是稳定存在，不可能提不出来吧。。。
3.“操作过程已经很是注意了，每一步都很小心的”如果你的洗液用久了，又没盖好的话，乙醇挥发了，是提 ...

所用质粒是实验室里常用的pGEX-5x-1，大肠杆菌宿主细胞，这麽多年了就没出过问题的。碱裂解法提质粒所用的溶液1,3配了储存液，每次用的时候取适量高压灭菌的，溶液2、70%乙醇每次都现配，NaAc也是用-20度的储存液.你的意思不是配培养条件的影响？
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5楼2011-09-26 18:56:55
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