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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » SDS-PAGE出现奇怪的拖尾
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lynic

新虫 (初入文坛)

[求助] SDS-PAGE出现奇怪的拖尾

本科时候跑了一年的E.coli，从来没出现这种情况：

用Pre-cast的胶，前两次跑过没问题，条带清晰蛋白分离很好；电泳缓冲液也是公司的，自己稀释，也是没问题的。电压一直是200V。跑的是全菌，不诱导表达的那种

现象：同一片胶Marker和另一种菌没有拖尾，但是E.coli拖尾严重，跑的时候就看到了，染色后一片模糊。E.coli的样品是新制的，小试管2ml培养7小时，样品处理方式不变，收菌后dI WATER洗两次，加loading buffer煮5分钟，上样量不大（按之前的经验值，上两次跑出的条带清晰分明）。

跑完以后想会不会是杂菌污染之类的问题，或者摇菌时间过长（36C，200rpm），重新挑单菌落接种，4小时培养。煮菌后不到5分钟就上样了依然拖尾，Marker和另一种菌则没有拖尾！！第二次跑胶时候看到上样孔那有残留物，但我确定用移液枪吸取样品时候没有粘稠状的东西~


求助各位，是不是DNA降解呢？但是之前相同条件，跑E.coli全菌，一直没有这种情况发生，即使是反复冻融的样品或者过夜培养，都没出现类似问题。请问出现了什么问题我忽略了的，应该怎么解决呢？

[ Last edited by 1949stone on 2011-9-29 at 11:39 ]
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1楼 2011-09-26 01:15:01
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分子菜鸟

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): good 2011-09-27 13:44:39
加上样缓冲液是不是混得不太均匀。上样孔要是有残留物应该是菌没煮好，加点8M尿素裂解一下，多煮一会，点样量小一点。
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2楼2011-09-27 10:43:21
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sapphire7000

新虫 (初入文坛)
学习中，，，，，，，，，
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3楼2011-09-27 11:57:49
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nach

铜虫 (著名写手)

不让吃就去死

【答案】应助回帖

不用超声破碎的吗
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不让吃就去死
4楼2011-09-27 19:59:24
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eileen8519

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-09-28 07:22:28
估计是蛋白浓度过高，条带没有分开，你减少加样量试试。我以前跑破碎细胞的沉淀，加过了之后，带型根本没有分开，就像你说的拖尾。
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5楼2011-09-27 23:29:49
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lynic

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by nach at 2011-09-27 19:59:24:
不用超声破碎的吗

提取包涵体我才用超声破碎的，一般跑个全菌图用不着
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6楼2011-09-29 10:32:52
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lynic

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 分子菜鸟 at 2011-09-27 10:43:21:
加上样缓冲液是不是混得不太均匀。上样孔要是有残留物应该是菌没煮好，加点8M尿素裂解一下，多煮一会，点样量小一点。

缓冲液公司的，均匀稀释；之前煮菌时间一样，5min，上样量有之前的经验值，肯定不高；
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7楼2011-09-29 10:50:47
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lynic

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
1楼: Originally posted by lynic at 2011-09-26 01:15:01:
本科时候跑了一年的E.coli，从来没出现这种情况：

用Pre-cast的胶，前两次跑过没问题，条带清晰蛋白分离很好；电泳缓冲液也是公司的，自己稀释，也是没问题的。电压一直是200V。跑的是全菌，不诱导表达的那种
...

这是第一次跑的胶，什么参数条件都一样，E.coli的全菌
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8楼2011-09-29 10:54:18
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JASON13

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): good 2011-09-29 18:47:21
确定没染噬菌体？bl21有时易染噬菌体。
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结构化生
9楼2011-09-29 15:54:20
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lynic

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by JASON13 at 2011-09-29 15:54:20:
确定没染噬菌体？bl21有时易染噬菌体。

应该没有；实验室不做噬菌体，就连E.coli也不经常培养
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10楼2011-09-30 02:04:47
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