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疯花血月

金虫 (初入文坛)

[交流] 蛋白包涵体透析后杂蛋白很多，请教原因 已有6人参与

我目的蛋白75Kd。蛋白表达后是包涵体，透析3 天后，然后我用超滤管离心，得到的蛋白跑胶，右边第四个条带。为什么包涵体透析后杂蛋白这么多呢？是因为蛋白是我浓缩后的原因吗？或者其他的原因


[ Last edited by 疯花血月 on 2011-9-15 at 20:47 ]
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1楼 2011-09-15 20:45:09
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healy13

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★
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西瓜(金币+2): 鼓励新虫交流 2011-09-16 17:43:27
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2楼2011-09-16 11:15:16
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疯花血月

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by healy13 at 2011-09-16 11:15:16:
目的条带下面的杂带分子量太小，需用层析技术来除杂。

按说破碎后包涵体泡PAGE胶有杂带，但是杂带不应该这么的亮。难道是因为蛋白是我浓缩后的原因？
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3楼2011-09-16 21:45:06
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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dhd997(金币+2): good 2011-09-17 10:42:50
包函怎么还这么杂呀，你这个确实不太好做呀，A600 1.5左右的时候开始25度过夜诱导试试吧，把表达做的好一点，可能就好做多了，另外你的蛋白要是蛋白酶的话浓度高了会自切的，不管有没有酶切位点，浓度做的低点或低温下做会好点的
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4楼2011-09-16 23:35:55
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★ ★ ★
1949stone(金币+3): 恩 很好 学习下 不过杂带多一般不会是没有洗净 2011-09-17 08:36:21
也有包函体没有洗净的嫌疑，洗的时候用超声波混均匀，有个三四次就会好多了，另外除内毒素的话也可以在这一步做
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5楼2011-09-16 23:38:43
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疯花血月

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ganchao1776 at 2011-09-16 23:35:55:
包函怎么还这么杂呀，你这个确实不太好做呀，A600 1.5左右的时候开始25度过夜诱导试试吧，把表达做的好一点，可能就好做多了，另外你的蛋白要是蛋白酶的话浓度高了会自切的，不管有没有酶切位点，浓度做的低点或低 ...

我也觉得温度降低诱导试一下了
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6楼2011-09-21 12:00:38
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imfly77

木虫 (小有名气)
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西瓜(金币+5): Good！ 2011-09-21 17:27:15
（1）从小条带的亮度来看，你做的包涵体蛋白很可能有大小亚基。或者也有可能有另一种蛋白共同过量表达。
（2）要除掉小蛋白，可以在目的蛋白上加上Histag，表达后将沉淀用8M尿素溶解，在变性条件（8M尿素）过Ni柱纯化。
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7楼2011-09-21 15:30:33
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穿白大褂约会

禁言 (小有名气)
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8楼2015-09-25 21:46:32
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1213902993

新虫 (初入文坛)
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引用回帖:
8楼: Originally posted by 穿白大褂约会 at 2015-09-25 21:46:32
先将包涵体用高浓度的尿素溶解，过柱纯化一下，再复性吧。上图包涵体洗涤的不够纯~~~

如何复性，试剂如何配。能否发一下？
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9楼2015-09-26 13:53:46
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saly40zz

禁言 (初入文坛)
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10楼2015-10-20 16:40:10
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