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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

[求助] PCR ， 双酶切，连接问题

请问一下PCR用高保真的酶P 3000多的片段，突变率大吗？还有PCR 的目的片段纯化后，双酶切效果如何？把两个目的片段同时往载体上连的话，一个片段是3000bp，一个是2000bp，载体5380bp，用的是TAKARA的连接试剂盒，两个片段的合适比例是多少啊？
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
1楼 2011-08-27 11:09:59
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔
引用回帖:
8楼: Originally posted by 青菜小虫 at 2011-08-27 19:47:35:
我就是为避免T载体，所以才选择PCR把很大的条带p出来的，之前把T载体的片段酶切下来往别的载体连接的时候，就算用切胶回收试剂盒，回收两次我老师说还是有T载体污染，我都不知道怎么办。。。所以采用这样的方法， ...

为什么会有T载体污染呢？
要做高难度的连接要保证DNA的质量，PCR胶回收恐怕不能很好保证
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一直向前！
9楼2011-08-28 08:21:40
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

青菜小虫(金币+5): 谢谢你的解答。 2011-08-27 14:26:48
1949stone(MolEPI+1): 这个要epi 13k的 可以么？ 2011-08-27 21:22:53
我们实验室扩增长片段常用的是Takara的primer star，有记录的是7.3k。没错碱基，楼主可以试一下！目的片段纯化后如果量足够大，酶切也没问题的，别忘了加上保护碱基。两个大片段往载体上连接难度可能大些，但也能成功，曾经连接过14k，1k，700bp的和7.3k，3.8k，700bp的能连上但费了不少功夫！关于比例这个楼主最好咨询一下技术顾问，偶也没太多的经验，就是多做了些连接转化就搞定了！
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jiayoubashaonian
2楼2011-08-27 12:08:07
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-27 12:08:07:
我们实验室扩增长片段常用的是Takara的primer star，有记录的是7.3k。没错碱基，楼主可以试一下！目的片段纯化后如果量足够大，酶切也没问题的，别忘了加上保护碱基。两个大片段往载体上连接难度可能大些，但也能 ...

你说的Takara的primer star，我在Takara的目录上没有找到，能给我具体指一下名称吗？还有目的片段纯化后酶切为什么要加保护碱基？再麻烦你一下啦
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
3楼2011-08-27 14:53:25
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-27 12:08:07:
我们实验室扩增长片段常用的是Takara的primer star，有记录的是7.3k。没错碱基，楼主可以试一下！目的片段纯化后如果量足够大，酶切也没问题的，别忘了加上保护碱基。两个大片段往载体上连接难度可能大些，但也能 ...

如果酶切位点不是很靠边的话，是不是保护碱基也可以不用加？
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
4楼2011-08-27 14:57:28
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