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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR ， 双酶切，连接问题
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

[求助] PCR ， 双酶切，连接问题

请问一下PCR用高保真的酶P 3000多的片段，突变率大吗？还有PCR 的目的片段纯化后，双酶切效果如何？把两个目的片段同时往载体上连的话，一个片段是3000bp，一个是2000bp，载体5380bp，用的是TAKARA的连接试剂盒，两个片段的合适比例是多少啊？
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
1楼 2011-08-27 11:09:59
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

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2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-27 12:08:07:
我们实验室扩增长片段常用的是Takara的primer star，有记录的是7.3k。没错碱基，楼主可以试一下！目的片段纯化后如果量足够大，酶切也没问题的，别忘了加上保护碱基。两个大片段往载体上连接难度可能大些，但也能 ...

你说的Takara的primer star，我在Takara的目录上没有找到，能给我具体指一下名称吗？还有目的片段纯化后酶切为什么要加保护碱基？再麻烦你一下啦
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
3楼2011-08-27 14:53:25
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

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2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-27 12:08:07:
我们实验室扩增长片段常用的是Takara的primer star，有记录的是7.3k。没错碱基，楼主可以试一下！目的片段纯化后如果量足够大，酶切也没问题的，别忘了加上保护碱基。两个大片段往载体上连接难度可能大些，但也能 ...

如果酶切位点不是很靠边的话，是不是保护碱基也可以不用加？
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
4楼2011-08-27 14:57:28
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青菜小虫

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风居住的街道

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7楼: Originally posted by zhangxn2010 at 2011-08-27 17:21:32:
我以前做载体构建用的都是pfu酶克隆片段，基本没出现错配现象，连接过程想保险的话还是要先连接T克隆载体，不过技术高超可以两片段和载体一起连接。
DNA回收的质量和连接太重要了，我曾经因为一个小细节白白做了 ...

我就是为避免T载体，所以才选择PCR把很大的条带p出来的，之前把T载体的片段酶切下来往别的载体连接的时候，就算用切胶回收试剂盒，回收两次我老师说还是有T载体污染，我都不知道怎么办。。。所以采用这样的方法，不过谢谢你的建议
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
8楼2011-08-27 19:47:35
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

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9楼: Originally posted by zhangxn2010 at 2011-08-28 08:21:40:
为什么会有T载体污染呢？
要做高难度的连接要保证DNA的质量，PCR胶回收恐怕不能很好保证

我也不知道怎么回事，每次切的时候自己都舍弃一些带，因为怕有杂带。我想问一下怎么保证DNA的质量？
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
10楼2011-08-28 09:17:34
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

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12楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-28 15:21:04:
楼主要的是连接正确的载体，在下以为楼主可以先将目的片段PCR，连接到测序载体上，获得正确的目的片段，大量摇菌提质粒，酶切回收，可能会含有载体的污染，但相信大部分应该是目的片段吧，然后将载体和两个片段用 ...

我就是这样子做的，但是菌落pcr只是验证你的目的片段的吧。这个是没问题的。就是两个不同的质粒酶切连接，谨小慎微的还是会出现载体污染，就算酶切时你保证没有杂带污染，但出来的结果。。。。。
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
15楼2011-08-29 14:22:17
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青菜小虫

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6楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-27 15:19:08:
1   PrimeSTAR HS DNA Polymerase是兼具高保真性和高扩增效率的PCR用DNA聚合酶。因其具有极强的3’→5’Exonuclease活性而显示出超群的校正功能，同时还具有优于Taq DNA Polymerase的高扩增效率。制品中添加了在 ...

这个方法不知能否行的通。我的差不多都是粘性末端连接，GC含量不是很高，总之谢谢你啊。。。
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
16楼2011-08-29 14:25:24
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青菜小虫

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14楼: Originally posted by 天使托 at 2011-08-28 22:23:47:
用taq plus酶应该没有什么问题的，3000bp的条带至于亮不亮就看你的PCR水准了，当然了不亮并不代表连接不上！
楼主做连接难道是想把两个外源片段同时连接进载体吗？不是这样最好，你可以先连接上一个，再酶切连接 ...

我是为了避免载体污染，所以把载体上的两个片段同时PCR方法得到后，然后纯化酶切，然后连到另外一个载体上的，实在没有别的方法了，才不得已而为之。我可以先试验一下，谢谢你的提议。
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
17楼2011-08-29 14:29:50
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