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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR ， 双酶切，连接问题
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

青菜小虫(金币+5): 谢谢你的解答。 2011-08-27 14:26:48
1949stone(MolEPI+1): 这个要epi 13k的 可以么？ 2011-08-27 21:22:53
我们实验室扩增长片段常用的是Takara的primer star，有记录的是7.3k。没错碱基，楼主可以试一下！目的片段纯化后如果量足够大，酶切也没问题的，别忘了加上保护碱基。两个大片段往载体上连接难度可能大些，但也能成功，曾经连接过14k，1k，700bp的和7.3k，3.8k，700bp的能连上但费了不少功夫！关于比例这个楼主最好咨询一下技术顾问，偶也没太多的经验，就是多做了些连接转化就搞定了！
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jiayoubashaonian
2楼2011-08-27 12:08:07
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zhangxn2010

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【答案】应助回帖

青菜小虫(金币+2): 谢谢你的建议 2011-08-27 19:47:58
1949stone(MolEPI+1): 都是牛人啊 2011-08-27 21:23:36
我以前做载体构建用的都是pfu酶克隆片段，基本没出现错配现象，连接过程想保险的话还是要先连接T克隆载体，不过技术高超可以两片段和载体一起连接。
DNA回收的质量和连接太重要了，我曾经因为一个小细节白白做了两个月，不过最后还是成功连接了。
像你这样两个大片段和载体相连不容易，细节决定成败。
祝你好运！
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一直向前！
7楼2011-08-27 17:21:32
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5): Good 2011-08-28 22:57:20
西瓜(MolEPI+1): 补上 2011-08-28 22:57:34
用taq plus酶应该没有什么问题的，3000bp的条带至于亮不亮就看你的PCR水准了，当然了不亮并不代表连接不上！
楼主做连接难道是想把两个外源片段同时连接进载体吗？不是这样最好，你可以先连接上一个，再酶切连接另外一个的，至于连接体系什么的，这得看你的载体和基因酶切纯化后的量了，如果量相当的话，基因可以是载体的2倍，具体还要定量的。。。一般原则上有公式：1/10<载体质量/载体大小/基因质量/基因的大小<1/3,按照这个公式你就可以直接算出你体系里面的各种物质的添加量了。。。
如果一次成功的话，基因一个礼拜你就可以搞定所有验证工作了，
祝你好运！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
14楼2011-08-28 22:23:47
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