应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR ， 双酶切，连接问题
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
51/1返回列表
查看: 3011  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 3 个 MolEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

[求助] PCR ， 双酶切，连接问题

请问一下PCR用高保真的酶P 3000多的片段，突变率大吗？还有PCR 的目的片段纯化后，双酶切效果如何？把两个目的片段同时往载体上连的话，一个片段是3000bp，一个是2000bp，载体5380bp，用的是TAKARA的连接试剂盒，两个片段的合适比例是多少啊？
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
1楼 2011-08-27 11:09:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔

【答案】应助回帖

青菜小虫(金币+2): 谢谢你的建议 2011-08-27 19:47:58
1949stone(MolEPI+1): 都是牛人啊 2011-08-27 21:23:36
我以前做载体构建用的都是pfu酶克隆片段，基本没出现错配现象，连接过程想保险的话还是要先连接T克隆载体，不过技术高超可以两片段和载体一起连接。
DNA回收的质量和连接太重要了，我曾经因为一个小细节白白做了两个月，不过最后还是成功连接了。
像你这样两个大片段和载体相连不容易，细节决定成败。
祝你好运！
赞一下(2人) 回复此楼
一直向前！
7楼2011-08-27 17:21:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 18 个回答

blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

青菜小虫(金币+5): 谢谢你的解答。 2011-08-27 14:26:48
1949stone(MolEPI+1): 这个要epi 13k的 可以么？ 2011-08-27 21:22:53
我们实验室扩增长片段常用的是Takara的primer star，有记录的是7.3k。没错碱基，楼主可以试一下！目的片段纯化后如果量足够大，酶切也没问题的，别忘了加上保护碱基。两个大片段往载体上连接难度可能大些，但也能成功，曾经连接过14k，1k，700bp的和7.3k，3.8k，700bp的能连上但费了不少功夫！关于比例这个楼主最好咨询一下技术顾问，偶也没太多的经验，就是多做了些连接转化就搞定了！
赞一下(1人) 回复此楼
jiayoubashaonian
2楼2011-08-27 12:08:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-27 12:08:07:
我们实验室扩增长片段常用的是Takara的primer star，有记录的是7.3k。没错碱基，楼主可以试一下！目的片段纯化后如果量足够大，酶切也没问题的，别忘了加上保护碱基。两个大片段往载体上连接难度可能大些，但也能 ...

你说的Takara的primer star，我在Takara的目录上没有找到，能给我具体指一下名称吗？还有目的片段纯化后酶切为什么要加保护碱基？再麻烦你一下啦
赞一下 回复此楼
生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
3楼2011-08-27 14:53:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-27 12:08:07:
我们实验室扩增长片段常用的是Takara的primer star，有记录的是7.3k。没错碱基，楼主可以试一下！目的片段纯化后如果量足够大，酶切也没问题的，别忘了加上保护碱基。两个大片段往载体上连接难度可能大些，但也能 ...

如果酶切位点不是很靠边的话，是不是保护碱基也可以不用加？
赞一下 回复此楼
生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
4楼2011-08-27 14:57:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 18 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 291求调剂 +7 孅華 2026-03-22 7/350 2026-03-28 04:02 by fmesaito
[考研] 266求调剂 +11 阳阳哇塞 2026-03-27 12/600 2026-03-27 17:56 by yu221
[考研] 化学调剂 +4 爱吃番茄的旭 2026-03-24 5/250 2026-03-27 17:50 by kiokin
[考研] 考研调剂 +4 Sanmu-124 2026-03-26 4/200 2026-03-27 17:49 by kiokin
[考研] 一志愿北京化工大学 070300 学硕 336分 求调剂 +9 vv迷 2026-03-22 9/450 2026-03-27 15:59 by 不吃魚的貓
[考研] 材料292调剂 +12 橘颂思美人 2026-03-23 12/600 2026-03-27 15:44 by caszguilin
[考研] 283求调剂（080500） +4 A child 2026-03-27 4/200 2026-03-27 15:34 by XPU李庆
[考研] 0856调剂 +5 求求让我有书读� 2026-03-26 6/300 2026-03-27 15:12 by caszguilin
[考研] 08开头275求调剂 +4 拉谁不重要 2026-03-26 4/200 2026-03-27 14:12 by Delta2012
[考研] 化学308分求调剂 +8 你好明天你好 2026-03-23 9/450 2026-03-27 14:01 by 杨光于青云
[考研] 286求调剂 +4 lim0922 2026-03-26 4/200 2026-03-27 10:28 by guoweigw
[考研] 359求调剂 +4 王了个楠 2026-03-25 4/200 2026-03-27 08:43 by 不吃魚的貓
[考研] 342求调剂 +3 加油a李zs 2026-03-26 3/150 2026-03-27 00:29 by wxiongid
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +3 崔wj 2026-03-26 3/150 2026-03-26 19:57 by nihaoar
[考研] 中国科学院深圳先进技术研究院-光纤传感课题组招生-中国科学院大学、深圳理工大学联培 +5 YangTyu1 2026-03-26 5/250 2026-03-26 18:27 by 猫咪猫咪呀
[考研] 材料专硕 335 分求调剂 +4 拒绝冷暴力 2026-03-25 4/200 2026-03-25 18:45 by haxia
[考研] 上海电力大学材料防护与新材料重点实验室招收调剂研究生（材料、化学、电化学，环境） +4 我爱学电池 2026-03-23 4/200 2026-03-25 00:59 by 1027_324
[考研] 284求调剂 +3 yanzhixue111 2026-03-23 6/300 2026-03-23 22:58 by pswait
[考研] 336化工调剂 +4 王大坦1 2026-03-23 5/250 2026-03-23 18:32 by allen-yin
[考研] 070300，一志愿北航320求调剂 +3 Jerry0216 2026-03-22 5/250 2026-03-23 09:16 by 。。堂堂
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭