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青菜小虫银虫 (著名写手)
风居住的街道
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[求助]
PCR ， 双酶切，连接问题
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| 请问一下PCR用高保真的酶P 3000多的片段，突变率大吗？还有PCR 的目的片段纯化后，双酶切效果如何？把两个目的片段同时往载体上连的话，一个片段是3000bp，一个是2000bp，载体5380bp，用的是TAKARA的连接试剂盒，两个片段的合适比例是多少啊？ |
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5): Good 2011-08-28 22:57:20
西瓜(MolEPI+1): 补上 2011-08-28 22:57:34
西瓜(金币+5): Good 2011-08-28 22:57:20
西瓜(MolEPI+1): 补上 2011-08-28 22:57:34
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用taq plus酶应该没有什么问题的，3000bp的条带至于亮不亮就看你的PCR水准了，当然了不亮并不代表连接不上！ 楼主做连接难道是想把两个外源片段同时连接进载体吗？不是这样最好，你可以先连接上一个，再酶切连接另外一个的，至于连接体系什么的，这得看你的载体和基因酶切纯化后的量了，如果量相当的话，基因可以是载体的2倍，具体还要定量的。。。一般原则上有公式：1/10<载体质量/载体大小/基因质量/基因的大小<1/3,按照这个公式你就可以直接算出你体系里面的各种物质的添加量了。。。 如果一次成功的话，基因一个礼拜你就可以搞定所有验证工作了， 祝你好运！ |
14楼2011-08-28 22:23:47
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【答案】应助回帖
青菜小虫(金币+5): 谢谢你的解答。 2011-08-27 14:26:48
1949stone(MolEPI+1): 这个要epi 13k的 可以么？ 2011-08-27 21:22:53
1949stone(MolEPI+1): 这个要epi 13k的 可以么？ 2011-08-27 21:22:53
我们实验室扩增长片段常用的是Takara的primer star，有记录的是7.3k。没错碱基，楼主可以试一下！目的片段纯化后如果量足够大，酶切也没问题的，别忘了加上保护碱基。两个大片段往载体上连接难度可能大些，但也能成功，曾经连接过14k，1k，700bp的和7.3k，3.8k，700bp的能连上但费了不少功夫！关于比例这个楼主最好咨询一下技术顾问，偶也没太多的经验，就是多做了些连接转化就搞定了！ |
2楼2011-08-27 12:08:07
青菜小虫
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3楼2011-08-27 14:53:25
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4楼2011-08-27 14:57:28