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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR ， 双酶切，连接问题
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔
★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励下！你说的这种PCR方法叫做巢式PCR，确实可以提高特异性。融合PCR不容易做，一般杂带比较多，需要再做一次巢式PCR得到纯的条带，而且融合之后还是得连接到载体上，感觉很麻烦啊。 2011-08-28 16:47:43
引用回帖:
10楼: Originally posted by 青菜小虫 at 2011-08-28 09:17:34:
我也不知道怎么回事，每次切的时候自己都舍弃一些带，因为怕有杂带。我想问一下怎么保证DNA的质量？

我还试过这样做，就是麻烦一些。
PCR用引物先外延一对，产物用作下步PCR模板，这样得率和质量都会高很多。

做载体构建还有一种方法是融合PCR（fusion PCR),无需酶切位点，直接PCR连接，有兴趣可以试试
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一直向前！
11楼2011-08-28 12:18:21
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good！ 2011-08-28 16:48:55
引用回帖:
10楼: Originally posted by 青菜小虫 at 2011-08-28 09:17:34:
我也不知道怎么回事，每次切的时候自己都舍弃一些带，因为怕有杂带。我想问一下怎么保证DNA的质量？

楼主要的是连接正确的载体，在下以为楼主可以先将目的片段PCR，连接到测序载体上，获得正确的目的片段，大量摇菌提质粒，酶切回收，可能会含有载体的污染，但相信大部分应该是目的片段吧，然后将载体和两个片段用不同浓度比例16度过夜连接，转化后菌落PCR验证后，再测序验证！不知道是不是和小虫的策略一致！供参考！
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jiayoubashaonian
12楼2011-08-28 15:21:04
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-29 07:38:21
直接用KOD酶，我最多扩过10k的长度，高保真。两个片段往载体上连，没有连过，但也有可能在挑大量的单克隆之后，能找到阳性的。我觉得还不如，先把两个片段连起来，然后两端设计引物P出一个连好的产物，然后再往载体上连。
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真相是最大的奢侈品
13楼2011-08-28 20:02:06
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5): Good 2011-08-28 22:57:20
西瓜(MolEPI+1): 补上 2011-08-28 22:57:34
用taq plus酶应该没有什么问题的，3000bp的条带至于亮不亮就看你的PCR水准了，当然了不亮并不代表连接不上！
楼主做连接难道是想把两个外源片段同时连接进载体吗？不是这样最好，你可以先连接上一个，再酶切连接另外一个的，至于连接体系什么的，这得看你的载体和基因酶切纯化后的量了，如果量相当的话，基因可以是载体的2倍，具体还要定量的。。。一般原则上有公式：1/10<载体质量/载体大小/基因质量/基因的大小<1/3,按照这个公式你就可以直接算出你体系里面的各种物质的添加量了。。。
如果一次成功的话，基因一个礼拜你就可以搞定所有验证工作了，
祝你好运！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
14楼2011-08-28 22:23:47
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

引用回帖:
12楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-28 15:21:04:
楼主要的是连接正确的载体，在下以为楼主可以先将目的片段PCR，连接到测序载体上，获得正确的目的片段，大量摇菌提质粒，酶切回收，可能会含有载体的污染，但相信大部分应该是目的片段吧，然后将载体和两个片段用 ...

我就是这样子做的，但是菌落pcr只是验证你的目的片段的吧。这个是没问题的。就是两个不同的质粒酶切连接，谨小慎微的还是会出现载体污染，就算酶切时你保证没有杂带污染，但出来的结果。。。。。
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
15楼2011-08-29 14:22:17
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

引用回帖:
6楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-27 15:19:08:
1   PrimeSTAR HS DNA Polymerase是兼具高保真性和高扩增效率的PCR用DNA聚合酶。因其具有极强的3’→5’Exonuclease活性而显示出超群的校正功能，同时还具有优于Taq DNA Polymerase的高扩增效率。制品中添加了在 ...

这个方法不知能否行的通。我的差不多都是粘性末端连接，GC含量不是很高，总之谢谢你啊。。。
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
16楼2011-08-29 14:25:24
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

引用回帖:
14楼: Originally posted by 天使托 at 2011-08-28 22:23:47:
用taq plus酶应该没有什么问题的，3000bp的条带至于亮不亮就看你的PCR水准了，当然了不亮并不代表连接不上！
楼主做连接难道是想把两个外源片段同时连接进载体吗？不是这样最好，你可以先连接上一个，再酶切连接 ...

我是为了避免载体污染，所以把载体上的两个片段同时PCR方法得到后，然后纯化酶切，然后连到另外一个载体上的，实在没有别的方法了，才不得已而为之。我可以先试验一下，谢谢你的提议。
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
17楼2011-08-29 14:29:50
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luoweijia

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zhangxn2010 at 2011-08-27 17:21:32
我以前做载体构建用的都是pfu酶克隆片段，基本没出现错配现象，连接过程想保险的话还是要先连接T克隆载体，不过技术高超可以两片段和载体一起连接。
DNA回收的质量和连接太重要了，我曾经因为一个小细节白白做了两 ...

你好，我是只新虫，想请教下你那个小小的细节是什么？我最近也在做克隆，方法和体系都是现成的，别人做转化率很高，但自己做怎么都做不出来。我在这里已经卡了有一个月了，现在很是郁闷~~~
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18楼2015-05-18 16:31:06
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