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dhd997荣誉版主 (文坛精英)
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分子生物版之电泳专题-重金奖励 已有45人参与
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我们学生物的会遇到很多电泳的问题，琼脂糖，SDS-PAGE等等。 开本帖的目的就是希望虫友们能把遇到的各种电泳，电泳试验方案，试验中遇到的问题以及解决方案，小经验，小总结分享出来。达到资源共享。 讲诉范围不限，只要是关于电泳的，电泳液，pH，电压，胶的制备等等各个方面都可以。最好是自己亲身经历的。 奖励措施：只要合理奖励5-50金币，EPI不等。 电泳试验方案列出一般奖励不多，方案一般都统一化了。对于试验中遇到的问题以及解决方案，小经验，小总结的分享，会重金奖励  欢迎大家积极参与。本活动的目的：当虫友遇到电泳问题的时候，希望只要看这一个帖子就可以解决问题。 [ Last edited by dhd997 on 2011-8-28 at 09:59 ] |
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1949stone
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2楼2011-08-21 13:20:48
wanhscn
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30楼2011-09-05 14:54:54
zhangxn2010
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dhd997(金币+10): 有意思 2011-09-17 09:18:57
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dhd997(金币+10): 有意思 2011-09-17 09:18:57
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关于电泳液我有个自己的经验，或者可以称为教训。 我们实验室一直用1*TAE做电泳液，有次冰乙酸没有了，临时决定用TBE做电泳缓冲液。我接下来的实验是要切胶回收的，用的国产tiangen试剂盒，后面的两个月我一直在重复回收连接，怎么连也连不到载体上。 后来逐个排除，原来问题出在了TBE上面，硼酸可以和DNA结合，不利于后续连接反应（至少对国产胶回收试剂盒是如此）。 希望我白白浪费两个月时间的教训能给大家以启发。 |
50楼2011-09-17 09:14:58
1949stone
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fdfbox3楼2011-08-21 13:21:32
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4楼2011-08-21 16:27:47
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amisking(金币+3, MolEPI+1): good！ 2011-08-21 19:46:02
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
amisking(金币+3, MolEPI+1): good！ 2011-08-21 19:46:02
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同学分享给我 我再次分享 准备干净的配胶板和电泳槽 注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。 选择电泳方法 一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。 正确选择凝胶浓度 对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。 适合的电泳缓冲液 常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。 电泳的合适电压和温度 电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15℃。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象。 DNA样品的纯度和状态 注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的NA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。 DNA的上样 正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。TIANGEN公司DNA分子量标准每次上样6ul即可得到清晰均匀的条带。 Marker的选择 DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。TIANGEN公司的DNA Marker条带清晰，亮度均匀，质量稳定，是您实验的首选。需要注意的是Marker的电泳同样也要符合DNA电泳的操作标准。如果选择λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要预先65℃加热5min，冰上冷却后使用。从而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。 凝胶的染色和观察 实验室常用的核酸染色剂是溴化乙啶（EB），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。而其他系列例如SYBR Green，GelRed，虽然毒性小，但价格昂贵。TIANGEN公司的GeneGreen相比则是性价比高的低毒替代染料，其灵敏度比传统EB染料高10倍以上。注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。 [ Last edited by 1949stone on 2011-8-21 at 16:51 ] |
5楼2011-08-21 16:48:21
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