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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 分子生物版之电泳专题-重金奖励
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dhd997

荣誉版主 (文坛精英)

自由人，我型我秀！

优秀版主

[交流] 分子生物版之电泳专题-重金奖励 已有45人参与

我们学生物的会遇到很多电泳的问题，琼脂糖，SDS-PAGE等等。

开本帖的目的就是希望虫友们能把遇到的各种电泳，电泳试验方案，试验中遇到的问题以及解决方案，小经验，小总结分享出来。达到资源共享。
讲诉范围不限，只要是关于电泳的，电泳液，pH，电压，胶的制备等等各个方面都可以。最好是自己亲身经历的。

奖励措施：只要合理奖励5-50金币，EPI不等。
电泳试验方案列出一般奖励不多，方案一般都统一化了。对于试验中遇到的问题以及解决方案，小经验，小总结的分享，会重金奖励

欢迎大家积极参与。

本活动的目的：当虫友遇到电泳问题的时候，希望只要看这一个帖子就可以解决问题。

[ Last edited by dhd997 on 2011-8-28 at 09:59 ]
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人生不过几十年，成败荣辱都在天，是非恩怨莫在意，健康快乐最值钱，自古人间苦无边，看得高远境如仙，愿你不为凡事恼，轻松快乐每一天。
1楼 2011-08-21 10:04:43
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1949stone

荣誉版主 (知名作家)

海纳百川
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+20, MolEPI+1): 第一个参与者，重金奖励。 2011-08-21 13:44:08
Electrophoresis in Practice
A Guide to Methods and Applications
of DNA and Protein Separations
Fourth

[ Last edited by 1949stone on 2011-8-21 at 13:44 ]
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fdfbox
海纳百川止于至善
3楼2011-08-21 13:21:32
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1949stone

荣誉版主 (知名作家)

海纳百川
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
amisking(金币+3, MolEPI+1): good！ 2011-08-21 19:46:02
同学分享给我 我再次分享

准备干净的配胶板和电泳槽         注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。

选择电泳方法         一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。

正确选择凝胶浓度         对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。

适合的电泳缓冲液         常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。

电泳的合适电压和温度         电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15℃。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象。

DNA样品的纯度和状态         注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的NA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。

DNA的上样         正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。TIANGEN公司DNA分子量标准每次上样6ul即可得到清晰均匀的条带。

Marker的选择         DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。TIANGEN公司的DNA Marker条带清晰，亮度均匀，质量稳定，是您实验的首选。需要注意的是Marker的电泳同样也要符合DNA电泳的操作标准。如果选择λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要预先65℃加热5min，冰上冷却后使用。从而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。

凝胶的染色和观察         实验室常用的核酸染色剂是溴化乙啶（EB），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。而其他系列例如SYBR Green，GelRed，虽然毒性小，但价格昂贵。TIANGEN公司的GeneGreen相比则是性价比高的低毒替代染料，其灵敏度比传统EB染料高10倍以上。注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。

[ Last edited by 1949stone on 2011-8-21 at 16:51 ]
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海纳百川止于至善
5楼2011-08-21 16:48:21
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西风的安逸

铜虫 (小有名气)
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dhd997(金币+20, MolEPI+1): 欢迎参与！ 2011-08-23 07:58:19
引用回帖:
1楼: Originally posted by dhd997 at 2011-08-21 10:04:43:
我们学生物的会遇到很多电泳的问题，琼脂糖，SDS-PAGE等等。

开本帖的目的就是希望虫友们能把遇到的各种电泳，电泳试验方案，试验中遇到的问题以及 ...

这是我之前分享的别人的，现在分享给大家，希望对大家有用
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既然选择了远方就要风雨兼程
7楼2011-08-22 20:43:55
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gwbk

木虫 (正式写手)
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dhd997(金币+40, MolEPI+1): 专家就是热心 2011-08-24 08:19:30
上传点动画，适合初学者：
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9楼2011-08-23 22:15:36
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
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dhd997(金币+20, MolEPI+1): 再详细一些？ 2011-08-24 08:20:17
电泳设备的组装不能算在电泳技术里；
电泳技术的关键主要有三点：一是配胶，二是样品准备，三是电泳参数选择；要想跑出一张漂亮的电泳图，这三点缺一不可；其实当你了解了其中的真谛了之后，你会发它们的选择其实还是瞒宽的。
说的有点太空了哈
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12楼2011-08-24 00:25:10
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
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dhd997(金币+10, MolEPI+1): 讲讲自己的经验啊 2011-08-24 08:20:51
http://wenku.baidu.com/view/317d1200de80d4d8d15a4f35.html
20种氨基酸的平均分子量为128，6个就是768，而40KD正负1还是可以分得开的，不算难。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
13楼2011-08-24 01:01:48
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tyhjqxbz

主管区长 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主优秀区长优秀版主优秀版主优秀版主
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dhd997(金币+1): 欢迎啊，上传成功，马上奖励 2011-09-04 11:28:46
dhd997(金币+15, MolEPI+1): 好像有点偏离主题的味道，不过还是欢迎啊，希望有人用得到，欢迎多来交流哦 2011-09-04 11:40:33
我也来分享一本书籍吧

电泳涂装

[ Last edited by tyhjqxbz on 2011-9-4 at 11:30 ]
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只为成功找方法，不为失败找借口——欢迎常到注册执考区
27楼2011-09-04 11:27:41
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bioliu8891

银虫 (初入文坛)
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dhd997(金币+15, MolEPI+1): 真实经验啊，用的时候仔细猜摸一下 2011-09-06 07:30:01
最近一直在做western，发现胶凝了后装板子前一定要把四周的胶抹净，不然会对结果有一定影响，其次就是加样孔里可能会有残胶或者其他东西，记得用枪头吹一下。转膜时一定要注意顺序摆放，只是对于甲醇活化时间还是有些疑惑，有人说10s,也有人说5min，我自己做的时候PVDF膜的透明程度也不一，不知道为什么
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32楼2011-09-05 20:28:59
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
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dhd997(金币+15, MolEPI+1): good 2011-09-07 07:35:08
对于150k左右的BAC文库的酶切指纹图谱的电泳，有两点说明
1 酶切产物（几百bp到几十K之间），琼脂糖胶的浓度要合适，1.2%-1.5%之间，浓度太小，小片段看不清，并且跑时间长了会化掉（一般过夜），浓度太大，大片段跑不开。
2 跑胶时，宜将槽子水平放在冰上，保持低温，这样小片段在长时间电泳下不易降解。电压小于40v。

[ Last edited by wanhscn on 2011-9-6 at 23:50 ]
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真相是最大的奢侈品
33楼2011-09-06 22:58:44
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