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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接体系的确定
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friya0910

新虫 (正式写手)

[求助] 连接体系的确定

这是我酶切载体和目的基因以后切胶回收的电泳图，左边为载体，右边为目的片段，上样量均为2微升，有没有高手帮我看看我的连接体系中载体和目的片段怎么定量啊？我用的是宝生物的T4连接酶，25微升的体系加1微升的酶和2.5微升的buffer。还有一个问题是连接之后的连接液可以直接做转化么？我看说明书上说还要加醋酸钠，无水乙醇沉淀等！
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1楼 2011-08-11 20:32:26
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
1楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-11 20:32:26:
这是我酶切载体和目的基因以后切胶回收的电泳图，左边为载体，右边为目的片段，上样量均为2微升，有没有高手帮我看看我的连接体系中载体和目的片段怎么定量啊？我用的是宝生物的T4连接酶，25微升的体系加1微升的酶 ...

补充说明，目的片段283bp，载体5900bp！
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2楼2011-08-11 20:36:48
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
friya0910(金币+2): 2011-08-11 21:33:22
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-08-11 22:37:29
我们常用的链接体系是：载体1ul；目的片段3.5ul或6ul；NEB或全式金连接酶1ul；连接酶Buffer；加水补足到10ul；转化时，加入的感受态体积至少为50ul，楼主可以试一下，祝楼主顺利！
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jiayoubashaonian
3楼2011-08-11 20:57:06
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friya0910

新虫 (正式写手)
西瓜: 一般要计算摩尔比，具体可以在论坛里面搜一下 2011-08-11 22:38:09
引用回帖:
3楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-11 20:57:06:
我们常用的链接体系是：载体1ul；目的片段3.5ul或6ul；NEB或全式金连接酶1ul；连接酶Buffer；加水补足到10ul；转化时，加入的感受态体积至少为50ul，楼主可以试一下，祝楼主顺利！

可是连接体系中加入载体和目的片段的量不是要根据你的载体和目的片段的浓度来确定的么？好像是要最终换算成摩尔比的!貌似比较复杂啊！
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4楼2011-08-11 21:34:34
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未知树

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
friya0910(金币+1): 2011-08-12 09:09:13
西瓜(金币+4): 几条带的是Maker吧 2011-08-12 17:55:13
楼主， 你的图片说明太模糊，别人没法给你出主意。
首先， 你的左边和右边， 怎么区分的问题。  
你有四条泳道都有带， 并且， 只是坐起第二个泳道是单带。 其他都是几条带。
看完之后， 我所能够给你提供的仅仅只有下面几点：
1，做连接之前， 必须保证， 回收之后电泳检验时，是单一条带，并且不要拖带。
,2，连接产物的比例。 这个确实需要按照DNA的量来计算， 不能按照体积比。
3，说明书说要加入乙酸钠和无水乙醇， 那是为了沉淀你的连接产物，除去盐离子和提高DNA的浓度。
    这样，你就能以尽量小的体积，尽量低的盐离子浓度，尽量高的浓度来进行转化，从而最大程度的提高转化效率和成功率。

祝你好运
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每一天都是一个新的起点
5楼2011-08-12 00:49:18
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未知树

木虫 (著名写手)
左起，写成坐起，汗一个
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每一天都是一个新的起点
6楼2011-08-12 00:50:02
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傻子

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
friya0910(金币+1): 2011-08-12 09:12:07
西瓜(金币+2): goood 2011-08-12 17:55:53
这个电泳图有4个条带，并且只有一个泳道是单条带的，所有不确定你的目的片段和载体在哪里。
具体的浓度可以依据marker条带来定量，具体参见说明书，会给出每个大小条带对应的DNA量。知道浓度后，再换算载体和目的片段的摩尔浓度。
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1984年中国制造,长173CM,净重64kg,采用人工智能，国家免检优质产品。
7楼2011-08-12 08:00:52
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

friya0910(金币+2): 2011-08-12 09:12:38
引用回帖:
4楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-11 21:34:34:
可是连接体系中加入载体和目的片段的量不是要根据你的载体和目的片段的浓度来确定的么？好像是要最终换算成摩尔比的!貌似比较复杂啊！

看到不少的资料里推荐的是载体与片段的摩尔比是：1：5-1：10，我们的实验发现初步估计浓度的情况下，完全可以通过改变加入的量的多少来满足条件，每次做时，发现至少有一个体系会得到阳性克隆，供参考，楼主可以试一下！
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jiayoubashaonian
8楼2011-08-12 09:00:18
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friya0910

新虫 (正式写手)
内容已删除
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9楼2011-08-12 09:10:46
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-12 09:00:18:
看到不少的资料里推荐的是载体与片段的摩尔比是：1：5-1：10，我们的实验发现初步估计浓度的情况下，完全可以通过改变加入的量的多少来满足条件，每次做时，发现至少有一个体系会得到阳性克隆，供参考，楼主可以 ...

您的意思是多做几个连接体系？还有就是我不知道怎么初步估计浓度，用凝胶成像系统从电泳上估计的话，初步估计的载体和目的片段的比为2-3吧，但是EB的涌动方向跟DNA相反，所以下面的胶很暗，而上面的胶很亮，两个背景不一样，这样比不太准确吧！
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10楼2011-08-12 09:17:15
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