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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
friya0910(金币+4): 2011-08-12 10:07:51
西瓜(金币+3, MolEPI+1): Good! 2011-08-12 11:18:57
1:你为何要点好几个marker,不知道是不是?
2:要做一个比较成功的连接,首先要保证载体和基因酶切的完全并且纯化的干净,这一点不知道楼主有无做到,由图中可以看出来载体还可以,但是基因有些少了,比较暗一点,但是没有关系连接体系中你可以加大基因的量;
3:连接体系的选择,一般情况下我们这里是10ul体系,当然了,还有别的连接体系,但是一般情况下10ul足矣,因为你做转化才需要几ul而已,没有必要太多,太多了反而不利于连接,10ul连接体系中:T4 DNAligase:0.5ul; Buffer:1ul,载体和基因根据电泳结果定量才可以知道,其实关键是要保证他们之间的一个浓度比,这样便于连接而已,按照你图中的亮度,载体加3ul,基因加6ul就可以了。
4:连接前,将载体和基因混合以后,在45度活化10min,连接完成之后也需要45度10min,当然不这样做也可以连接上,这一步只是辅助而已!
祝好运!
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
11楼2011-08-12 09:56:54
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friya0910

新虫 (正式写手)

引用回帖:
1楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-11 20:32:26:
这是我酶切载体和目的基因以后切胶回收的电泳图,左边为载体,右边为目的片段,上样量均为2微升,有没有高手帮我看看我的连接体系中载体和目的片段怎么定量啊?我用的是宝生物的T4连接酶,25微升的体系加1微升的酶 ...

我已经计算出我的载体在体系中如果是0.03pmol的话,就需要加0.11682微克,目的片段在体系中如果是0.3pmol的话,就需要加0.05643微克,有没有哪位高人能帮我结合我的电泳图看一下具体25微升体系中加多少体积的载体和目的片段啊?万分感谢!
12楼2011-08-12 10:06:37
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friya0910

新虫 (正式写手)

引用回帖:
11楼: Originally posted by 天使托 at 2011-08-12 09:56:54:
1:你为何要点好几个marker,不知道是不是?
2:要做一个比较成功的连接,首先要保证载体和基因酶切的完全并且纯化的干净,这一点不知道楼主有无做到,由图中可以看出来载体还可以,但是基因有些少了,比较暗一点 ...

因为想更确定一下切下来的片段大小。我是把载体用NcoI单酶切一管,用BamHI单酶切一管,然后双酶切一管,跑胶显示三管都是线性的,这样是不是就能说明载体切干净了啊?目的片段是从T载体上切下来的,应该问题不大,就是浓度低了点,不知道会不会影响后面的连接。我想请问一下高人,你们加多少载体和目的片段是不是都是通过电泳图,然后凭经验的呀?这个比例对最后能否连接成功是不是很关键哪?
还有我用网上的公式算了一下,我需要加的载体的量为0.11682微克,目的片段的量为0.05643微克,那么如何根据我的电泳图去确定加的体积呢?因为载体和目的片段所在胶的位置背景不一样,纯粹看亮度不准吧!
13楼2011-08-12 10:15:52
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friya0910

新虫 (正式写手)

引用回帖:
11楼: Originally posted by 天使托 at 2011-08-12 09:56:54:
1:你为何要点好几个marker,不知道是不是?
2:要做一个比较成功的连接,首先要保证载体和基因酶切的完全并且纯化的干净,这一点不知道楼主有无做到,由图中可以看出来载体还可以,但是基因有些少了,比较暗一点 ...

转化一般不都是10微升连接液转100微升感受态吗?我用的是宝生物的T4连接酶,说明书上的连接体系是25微升的,我能做10微升的吗?如果可以的话还节约酶呢!
14楼2011-08-12 10:19:44
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

★ ★
西瓜(金币+2): 专家很热心 2011-08-12 17:56:59
引用回帖:
13楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-12 10:15:52:
因为想更确定一下切下来的片段大小。我是把载体用NcoI单酶切一管,用BamHI单酶切一管,然后双酶切一管,跑胶显示三管都是线性的,这样是不是就能说明载体切干净了啊?目的片段是从T载体上切下来的,应该问题不大 ...

网上的公式切勿死板硬套,两者加的比例有一个范围的,要定量一下,其实做的多了,只要肉眼一看便知道大概加多少,没有必要那么精准,做一个克隆不需要浪费那么多时间的。
那么定量呢?就是跟你marker比的,你点了几微升marker 哪一条带最亮,是多少ng,然后再对比你的条带的。。。可能我说的不是很清楚,你看看marker的那张图,每一个大小都是一定的质量。。。

另外转化的话,连接产物转4ul至60或者70ul感受态就行了。。。。
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
15楼2011-08-12 10:26:36
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friya0910

新虫 (正式写手)

引用回帖:
15楼: Originally posted by 天使托 at 2011-08-12 10:26:36:
网上的公式切勿死板硬套,两者加的比例有一个范围的,要定量一下,其实做的多了,只要肉眼一看便知道大概加多少,没有必要那么精准,做一个克隆不需要浪费那么多时间的。
那么定量呢?就是跟你marker比的,你点 ...

多谢您的指点,因为是第一次做,所以总怕出错,特别小心翼翼!
16楼2011-08-12 10:32:38
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
10楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-12 09:17:15:
您的意思是多做几个连接体系?还有就是我不知道怎么初步估计浓度,用凝胶成像系统从电泳上估计的话,初步估计的载体和目的片段的比为2-3吧,但是EB的涌动方向跟DNA相反,所以下面的胶很暗,而上面的胶很亮,两个 ...

是的,我们一般做两个,目的片段3.5和6ul的各一个,载体1ul,酶1ul,buffer,用水补足到10ul,16度连接过夜,后转化全式金TransT1,以前用过TOP10效果不是太好!用的感受态体积至少为连接体系的5倍,祝楼主顺利!
jiayoubashaonian
17楼2011-08-12 10:37:59
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peace12039088

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 做多了就可以凭经验来判断了 2011-08-12 17:58:39
楼主做实验很小心谨慎啊,不过事实上做实验是应该如此的。
连接体系你可以按照说明书减半使用或者按比例做成10ul的体系均可,之前我一直使用TaKaRa的连接酶,都是用10ul的连接体系,而且实验室的人都是用10ul的体系。这样的体系不会影响最后的连接效果的。连接产物可以用2-10ul均可,最初我用的少,后来就全部转啦,因为如果出问题,都会重新开始,而不会再用已有的连接液。还有就是感受态也是用50ul左右,很少用100ul的。总之,就是将说明书提供的标准体系都减半(或一半多)使用了。
关于连接中的载体与目标片段的问题。首先没有完全必要按照公式来套,因为回收后的载体及目标片段一般是很难绝对定量的,所以一般人应该都是根据回收后的亮度来作为加入的依据的。但需要注意的一点是,同样亮度的不同大小的片段,大片段的浓度要高于小片段的,所以有了这个前提,就可以凭感觉来加入了,这样讲可能看起来很不敬业的,但事实上就是这样的,你自己尝试几次就可完全领会了。
啰嗦了很多,希望可以对你有用。尽量相信自己,很多人刚开始接触实验,都会有与你类似的疑问和心情。
18楼2011-08-12 10:51:06
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friya0910

新虫 (正式写手)

引用回帖:
18楼: Originally posted by peace12039088 at 2011-08-12 10:51:06:
楼主做实验很小心谨慎啊,不过事实上做实验是应该如此的。
连接体系你可以按照说明书减半使用或者按比例做成10ul的体系均可,之前我一直使用TaKaRa的连接酶,都是用10ul的连接体系,而且实验室的人都是用10ul的体 ...

多谢啊!
19楼2011-08-12 11:02:30
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20楼2011-08-12 12:24:04
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