【答案】应助回帖

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11楼2011-08-12 09:56:54

friya0910

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1楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-11 20:32:26:
这是我酶切载体和目的基因以后切胶回收的电泳图，左边为载体，右边为目的片段，上样量均为2微升，有没有高手帮我看看我的连接体系中载体和目的片段怎么定量啊？我用的是宝生物的T4连接酶，25微升的体系加1微升的酶 ...

我已经计算出我的载体在体系中如果是0.03pmol的话，就需要加0.11682微克，目的片段在体系中如果是0.3pmol的话，就需要加0.05643微克，有没有哪位高人能帮我结合我的电泳图看一下具体25微升体系中加多少体积的载体和目的片段啊？万分感谢！

12楼2011-08-12 10:06:37

friya0910

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11楼: Originally posted by 天使托 at 2011-08-12 09:56:54:
1：你为何要点好几个marker，不知道是不是？
2：要做一个比较成功的连接，首先要保证载体和基因酶切的完全并且纯化的干净，这一点不知道楼主有无做到，由图中可以看出来载体还可以，但是基因有些少了，比较暗一点 ...

因为想更确定一下切下来的片段大小。我是把载体用NcoI单酶切一管，用BamHI单酶切一管，然后双酶切一管，跑胶显示三管都是线性的，这样是不是就能说明载体切干净了啊？目的片段是从T载体上切下来的，应该问题不大，就是浓度低了点，不知道会不会影响后面的连接。我想请问一下高人，你们加多少载体和目的片段是不是都是通过电泳图，然后凭经验的呀？这个比例对最后能否连接成功是不是很关键哪？
还有我用网上的公式算了一下，我需要加的载体的量为0.11682微克，目的片段的量为0.05643微克，那么如何根据我的电泳图去确定加的体积呢？因为载体和目的片段所在胶的位置背景不一样，纯粹看亮度不准吧！

13楼2011-08-12 10:15:52

friya0910

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转化一般不都是10微升连接液转100微升感受态吗？我用的是宝生物的T4连接酶，说明书上的连接体系是25微升的，我能做10微升的吗？如果可以的话还节约酶呢！

14楼2011-08-12 10:19:44

天使托

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西瓜(金币+2): 专家很热心 2011-08-12 17:56:59

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13楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-12 10:15:52:
因为想更确定一下切下来的片段大小。我是把载体用NcoI单酶切一管，用BamHI单酶切一管，然后双酶切一管，跑胶显示三管都是线性的，这样是不是就能说明载体切干净了啊？目的片段是从T载体上切下来的，应该问题不大 ...

网上的公式切勿死板硬套，两者加的比例有一个范围的，要定量一下，其实做的多了，只要肉眼一看便知道大概加多少，没有必要那么精准，做一个克隆不需要浪费那么多时间的。
那么定量呢？就是跟你marker比的，你点了几微升marker 哪一条带最亮，是多少ng，然后再对比你的条带的。。。可能我说的不是很清楚，你看看marker的那张图，每一个大小都是一定的质量。。。

另外转化的话，连接产物转4ul至60或者70ul感受态就行了。。。。

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15楼2011-08-12 10:26:36

friya0910

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15楼: Originally posted by 天使托 at 2011-08-12 10:26:36:
网上的公式切勿死板硬套，两者加的比例有一个范围的，要定量一下，其实做的多了，只要肉眼一看便知道大概加多少，没有必要那么精准，做一个克隆不需要浪费那么多时间的。
那么定量呢？就是跟你marker比的，你点 ...

多谢您的指点，因为是第一次做，所以总怕出错，特别小心翼翼！

16楼2011-08-12 10:32:38

blackrose8089

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10楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-12 09:17:15:
您的意思是多做几个连接体系？还有就是我不知道怎么初步估计浓度，用凝胶成像系统从电泳上估计的话，初步估计的载体和目的片段的比为2-3吧，但是EB的涌动方向跟DNA相反，所以下面的胶很暗，而上面的胶很亮，两个 ...

是的，我们一般做两个，目的片段3.5和6ul的各一个，载体1ul，酶1ul，buffer，用水补足到10ul，16度连接过夜，后转化全式金TransT1，以前用过TOP10效果不是太好！用的感受态体积至少为连接体系的5倍，祝楼主顺利！

jiayoubashaonian

17楼2011-08-12 10:37:59

peace12039088

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【答案】应助回帖

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西瓜(金币+5, MolEPI+1): 做多了就可以凭经验来判断了 2011-08-12 17:58:39

楼主做实验很小心谨慎啊，不过事实上做实验是应该如此的。
连接体系你可以按照说明书减半使用或者按比例做成10ul的体系均可，之前我一直使用TaKaRa的连接酶，都是用10ul的连接体系，而且实验室的人都是用10ul的体系。这样的体系不会影响最后的连接效果的。连接产物可以用2-10ul均可，最初我用的少，后来就全部转啦，因为如果出问题，都会重新开始，而不会再用已有的连接液。还有就是感受态也是用50ul左右，很少用100ul的。总之，就是将说明书提供的标准体系都减半（或一半多）使用了。
关于连接中的载体与目标片段的问题。首先没有完全必要按照公式来套，因为回收后的载体及目标片段一般是很难绝对定量的，所以一般人应该都是根据回收后的亮度来作为加入的依据的。但需要注意的一点是，同样亮度的不同大小的片段，大片段的浓度要高于小片段的，所以有了这个前提，就可以凭感觉来加入了，这样讲可能看起来很不敬业的，但事实上就是这样的，你自己尝试几次就可完全领会了。
啰嗦了很多，希望可以对你有用。尽量相信自己，很多人刚开始接触实验，都会有与你类似的疑问和心情。

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18楼2011-08-12 10:51:06

friya0910

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18楼: Originally posted by peace12039088 at 2011-08-12 10:51:06:
楼主做实验很小心谨慎啊，不过事实上做实验是应该如此的。
连接体系你可以按照说明书减半使用或者按比例做成10ul的体系均可，之前我一直使用TaKaRa的连接酶，都是用10ul的连接体系，而且实验室的人都是用10ul的体 ...

多谢啊！

19楼2011-08-12 11:02:30

wytwsm

20楼2011-08-12 12:24:04