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friya0910新虫 (正式写手)
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[求助]
连接体系的确定
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这是我酶切载体和目的基因以后切胶回收的电泳图，左边为载体，右边为目的片段，上样量均为2微升，有没有高手帮我看看我的连接体系中载体和目的片段怎么定量啊？我用的是宝生物的T4连接酶，25微升的体系加1微升的酶和2.5微升的buffer。还有一个问题是连接之后的连接液可以直接做转化么？我看说明书上说还要加醋酸钠，无水乙醇沉淀等！ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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peace12039088
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【答案】应助回帖
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西瓜(金币+5, MolEPI+1): 做多了就可以凭经验来判断了 2011-08-12 17:58:39
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 做多了就可以凭经验来判断了 2011-08-12 17:58:39
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楼主做实验很小心谨慎啊，不过事实上做实验是应该如此的。 连接体系你可以按照说明书减半使用或者按比例做成10ul的体系均可，之前我一直使用TaKaRa的连接酶，都是用10ul的连接体系，而且实验室的人都是用10ul的体系。这样的体系不会影响最后的连接效果的。连接产物可以用2-10ul均可，最初我用的少，后来就全部转啦，因为如果出问题，都会重新开始，而不会再用已有的连接液。还有就是感受态也是用50ul左右，很少用100ul的。总之，就是将说明书提供的标准体系都减半（或一半多）使用了。 关于连接中的载体与目标片段的问题。首先没有完全必要按照公式来套，因为回收后的载体及目标片段一般是很难绝对定量的，所以一般人应该都是根据回收后的亮度来作为加入的依据的。但需要注意的一点是，同样亮度的不同大小的片段，大片段的浓度要高于小片段的，所以有了这个前提，就可以凭感觉来加入了，这样讲可能看起来很不敬业的，但事实上就是这样的，你自己尝试几次就可完全领会了。 啰嗦了很多，希望可以对你有用。尽量相信自己，很多人刚开始接触实验，都会有与你类似的疑问和心情。 |
18楼2011-08-12 10:51:06