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南方科技大学公共卫生及应急管理学院2025级博士研究生招生报考通知
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
friya0910(金币+4): 2011-08-12 10:07:51
西瓜(金币+3, MolEPI+1): Good! 2011-08-12 11:18:57
1:你为何要点好几个marker,不知道是不是?
2:要做一个比较成功的连接,首先要保证载体和基因酶切的完全并且纯化的干净,这一点不知道楼主有无做到,由图中可以看出来载体还可以,但是基因有些少了,比较暗一点,但是没有关系连接体系中你可以加大基因的量;
3:连接体系的选择,一般情况下我们这里是10ul体系,当然了,还有别的连接体系,但是一般情况下10ul足矣,因为你做转化才需要几ul而已,没有必要太多,太多了反而不利于连接,10ul连接体系中:T4 DNAligase:0.5ul; Buffer:1ul,载体和基因根据电泳结果定量才可以知道,其实关键是要保证他们之间的一个浓度比,这样便于连接而已,按照你图中的亮度,载体加3ul,基因加6ul就可以了。
4:连接前,将载体和基因混合以后,在45度活化10min,连接完成之后也需要45度10min,当然不这样做也可以连接上,这一步只是辅助而已!
祝好运!
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
11楼2011-08-12 09:56:54
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智能机器人

Robot (super robot)

我们都爱小木虫

peace12039088

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 做多了就可以凭经验来判断了 2011-08-12 17:58:39
楼主做实验很小心谨慎啊,不过事实上做实验是应该如此的。
连接体系你可以按照说明书减半使用或者按比例做成10ul的体系均可,之前我一直使用TaKaRa的连接酶,都是用10ul的连接体系,而且实验室的人都是用10ul的体系。这样的体系不会影响最后的连接效果的。连接产物可以用2-10ul均可,最初我用的少,后来就全部转啦,因为如果出问题,都会重新开始,而不会再用已有的连接液。还有就是感受态也是用50ul左右,很少用100ul的。总之,就是将说明书提供的标准体系都减半(或一半多)使用了。
关于连接中的载体与目标片段的问题。首先没有完全必要按照公式来套,因为回收后的载体及目标片段一般是很难绝对定量的,所以一般人应该都是根据回收后的亮度来作为加入的依据的。但需要注意的一点是,同样亮度的不同大小的片段,大片段的浓度要高于小片段的,所以有了这个前提,就可以凭感觉来加入了,这样讲可能看起来很不敬业的,但事实上就是这样的,你自己尝试几次就可完全领会了。
啰嗦了很多,希望可以对你有用。尽量相信自己,很多人刚开始接触实验,都会有与你类似的疑问和心情。
18楼2011-08-12 10:51:06
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