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天使托

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T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
friya0910(金币+4): 2011-08-12 10:07:51
西瓜(金币+3, MolEPI+1): Good！ 2011-08-12 11:18:57
1：你为何要点好几个marker，不知道是不是？
2：要做一个比较成功的连接，首先要保证载体和基因酶切的完全并且纯化的干净，这一点不知道楼主有无做到，由图中可以看出来载体还可以，但是基因有些少了，比较暗一点，但是没有关系连接体系中你可以加大基因的量；
3：连接体系的选择，一般情况下我们这里是10ul体系，当然了，还有别的连接体系，但是一般情况下10ul足矣，因为你做转化才需要几ul而已，没有必要太多，太多了反而不利于连接，10ul连接体系中：T4 DNAligase:0.5ul; Buffer：1ul,载体和基因根据电泳结果定量才可以知道，其实关键是要保证他们之间的一个浓度比，这样便于连接而已，按照你图中的亮度，载体加3ul，基因加6ul就可以了。
4：连接前，将载体和基因混合以后，在45度活化10min，连接完成之后也需要45度10min，当然不这样做也可以连接上，这一步只是辅助而已！
祝好运！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
11楼2011-08-12 09:56:54
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【答案】应助回帖

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西瓜(金币+5, MolEPI+1): 做多了就可以凭经验来判断了 2011-08-12 17:58:39
楼主做实验很小心谨慎啊，不过事实上做实验是应该如此的。
连接体系你可以按照说明书减半使用或者按比例做成10ul的体系均可，之前我一直使用TaKaRa的连接酶，都是用10ul的连接体系，而且实验室的人都是用10ul的体系。这样的体系不会影响最后的连接效果的。连接产物可以用2-10ul均可，最初我用的少，后来就全部转啦，因为如果出问题，都会重新开始，而不会再用已有的连接液。还有就是感受态也是用50ul左右，很少用100ul的。总之，就是将说明书提供的标准体系都减半（或一半多）使用了。
关于连接中的载体与目标片段的问题。首先没有完全必要按照公式来套，因为回收后的载体及目标片段一般是很难绝对定量的，所以一般人应该都是根据回收后的亮度来作为加入的依据的。但需要注意的一点是，同样亮度的不同大小的片段，大片段的浓度要高于小片段的，所以有了这个前提，就可以凭感觉来加入了，这样讲可能看起来很不敬业的，但事实上就是这样的，你自己尝试几次就可完全领会了。
啰嗦了很多，希望可以对你有用。尽量相信自己，很多人刚开始接触实验，都会有与你类似的疑问和心情。
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18楼2011-08-12 10:51:06
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