| 查看: 2783 | 回复: 19 | |||||
| 本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | |||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||||
friya0910新虫 (正式写手)
|
[求助]
连接体系的确定
|
||||
这是我酶切载体和目的基因以后切胶回收的电泳图，左边为载体，右边为目的片段，上样量均为2微升，有没有高手帮我看看我的连接体系中载体和目的片段怎么定量啊？我用的是宝生物的T4连接酶，25微升的体系加1微升的酶和2.5微升的buffer。还有一个问题是连接之后的连接液可以直接做转化么？我看说明书上说还要加醋酸钠，无水乙醇沉淀等！ |
回复此楼» 猜你喜欢
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有205人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
天使托
专家顾问 (职业作家)
T.Shen
-
专家经验: +57 - MolEPI: 106
- 应助: 95 (初中生)
- 贵宾: 0.263
- 金币: 16382.3
- 散金: 593
- 红花: 74
- 沙发: 9
- 帖子: 3648
- 在线: 288.2小时
- 虫号: 441757
- 注册: 2007-10-27
- 专业: 微生物生理与生物化学
- 管辖: 微生物
【答案】应助回帖
★ ★ ★
friya0910(金币+4): 2011-08-12 10:07:51
西瓜(金币+3, MolEPI+1): Good！ 2011-08-12 11:18:57
friya0910(金币+4): 2011-08-12 10:07:51
西瓜(金币+3, MolEPI+1): Good！ 2011-08-12 11:18:57
|
1：你为何要点好几个marker，不知道是不是？ 2：要做一个比较成功的连接，首先要保证载体和基因酶切的完全并且纯化的干净，这一点不知道楼主有无做到，由图中可以看出来载体还可以，但是基因有些少了，比较暗一点，但是没有关系连接体系中你可以加大基因的量； 3：连接体系的选择，一般情况下我们这里是10ul体系，当然了，还有别的连接体系，但是一般情况下10ul足矣，因为你做转化才需要几ul而已，没有必要太多，太多了反而不利于连接，10ul连接体系中：T4 DNAligase:0.5ul; Buffer：1ul,载体和基因根据电泳结果定量才可以知道，其实关键是要保证他们之间的一个浓度比，这样便于连接而已，按照你图中的亮度，载体加3ul，基因加6ul就可以了。 4：连接前，将载体和基因混合以后，在45度活化10min，连接完成之后也需要45度10min，当然不这样做也可以连接上，这一步只是辅助而已！ 祝好运！ |
11楼2011-08-12 09:56:54
friya0910
新虫 (正式写手)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 19.4
- 散金: 360
- 帖子: 401
- 在线: 77.4小时
- 虫号: 1073675
- 注册: 2010-08-12
- 专业: 作物分子育种
2楼2011-08-11 20:36:48
blackrose8089
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 16
- 应助: 100 (初中生)
- 贵宾: 0.11
- 金币: 10636.6
- 散金: 155
- 红花: 30
- 沙发: 6
- 帖子: 3702
- 在线: 790.1小时
- 虫号: 614948
- 注册: 2008-09-28
- 专业: 植物学研究的新技术、新方
3楼2011-08-11 20:57:06
friya0910
新虫 (正式写手)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 19.4
- 散金: 360
- 帖子: 401
- 在线: 77.4小时
- 虫号: 1073675
- 注册: 2010-08-12
- 专业: 作物分子育种
4楼2011-08-11 21:34:34