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friya0910新虫 (正式写手)
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[求助]
连接体系的确定
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这是我酶切载体和目的基因以后切胶回收的电泳图，左边为载体，右边为目的片段，上样量均为2微升，有没有高手帮我看看我的连接体系中载体和目的片段怎么定量啊？我用的是宝生物的T4连接酶，25微升的体系加1微升的酶和2.5微升的buffer。还有一个问题是连接之后的连接液可以直接做转化么？我看说明书上说还要加醋酸钠，无水乙醇沉淀等！ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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【答案】应助回帖
★ ★ ★
friya0910(金币+4): 2011-08-12 10:07:51
西瓜(金币+3, MolEPI+1): Good！ 2011-08-12 11:18:57
friya0910(金币+4): 2011-08-12 10:07:51
西瓜(金币+3, MolEPI+1): Good！ 2011-08-12 11:18:57
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1：你为何要点好几个marker，不知道是不是？ 2：要做一个比较成功的连接，首先要保证载体和基因酶切的完全并且纯化的干净，这一点不知道楼主有无做到，由图中可以看出来载体还可以，但是基因有些少了，比较暗一点，但是没有关系连接体系中你可以加大基因的量； 3：连接体系的选择，一般情况下我们这里是10ul体系，当然了，还有别的连接体系，但是一般情况下10ul足矣，因为你做转化才需要几ul而已，没有必要太多，太多了反而不利于连接，10ul连接体系中：T4 DNAligase:0.5ul; Buffer：1ul,载体和基因根据电泳结果定量才可以知道，其实关键是要保证他们之间的一个浓度比，这样便于连接而已，按照你图中的亮度，载体加3ul，基因加6ul就可以了。 4：连接前，将载体和基因混合以后，在45度活化10min，连接完成之后也需要45度10min，当然不这样做也可以连接上，这一步只是辅助而已！ 祝好运！ |
11楼2011-08-12 09:56:54
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15楼2011-08-12 10:26:36