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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接体系的确定
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friya0910

新虫 (正式写手)

[求助] 连接体系的确定

这是我酶切载体和目的基因以后切胶回收的电泳图，左边为载体，右边为目的片段，上样量均为2微升，有没有高手帮我看看我的连接体系中载体和目的片段怎么定量啊？我用的是宝生物的T4连接酶，25微升的体系加1微升的酶和2.5微升的buffer。还有一个问题是连接之后的连接液可以直接做转化么？我看说明书上说还要加醋酸钠，无水乙醇沉淀等！
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1楼 2011-08-11 20:32:26
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 天使托 at 2011-08-12 09:56:54:
1：你为何要点好几个marker，不知道是不是？
2：要做一个比较成功的连接，首先要保证载体和基因酶切的完全并且纯化的干净，这一点不知道楼主有无做到，由图中可以看出来载体还可以，但是基因有些少了，比较暗一点 ...

转化一般不都是10微升连接液转100微升感受态吗？我用的是宝生物的T4连接酶，说明书上的连接体系是25微升的，我能做10微升的吗？如果可以的话还节约酶呢！
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14楼2011-08-12 10:19:44
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
1楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-11 20:32:26:
这是我酶切载体和目的基因以后切胶回收的电泳图，左边为载体，右边为目的片段，上样量均为2微升，有没有高手帮我看看我的连接体系中载体和目的片段怎么定量啊？我用的是宝生物的T4连接酶，25微升的体系加1微升的酶 ...

补充说明，目的片段283bp，载体5900bp！
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2楼2011-08-11 20:36:48
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
friya0910(金币+2): 2011-08-11 21:33:22
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-08-11 22:37:29
我们常用的链接体系是：载体1ul；目的片段3.5ul或6ul；NEB或全式金连接酶1ul；连接酶Buffer；加水补足到10ul；转化时，加入的感受态体积至少为50ul，楼主可以试一下，祝楼主顺利！
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jiayoubashaonian
3楼2011-08-11 20:57:06
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friya0910

新虫 (正式写手)
西瓜: 一般要计算摩尔比，具体可以在论坛里面搜一下 2011-08-11 22:38:09
引用回帖:
3楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-11 20:57:06:
我们常用的链接体系是：载体1ul；目的片段3.5ul或6ul；NEB或全式金连接酶1ul；连接酶Buffer；加水补足到10ul；转化时，加入的感受态体积至少为50ul，楼主可以试一下，祝楼主顺利！

可是连接体系中加入载体和目的片段的量不是要根据你的载体和目的片段的浓度来确定的么？好像是要最终换算成摩尔比的!貌似比较复杂啊！
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4楼2011-08-11 21:34:34
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