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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接体系的确定
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friya0910

新虫 (正式写手)

[求助] 连接体系的确定

这是我酶切载体和目的基因以后切胶回收的电泳图，左边为载体，右边为目的片段，上样量均为2微升，有没有高手帮我看看我的连接体系中载体和目的片段怎么定量啊？我用的是宝生物的T4连接酶，25微升的体系加1微升的酶和2.5微升的buffer。还有一个问题是连接之后的连接液可以直接做转化么？我看说明书上说还要加醋酸钠，无水乙醇沉淀等！
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1楼 2011-08-11 20:32:26
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-12 09:00:18:
看到不少的资料里推荐的是载体与片段的摩尔比是：1：5-1：10，我们的实验发现初步估计浓度的情况下，完全可以通过改变加入的量的多少来满足条件，每次做时，发现至少有一个体系会得到阳性克隆，供参考，楼主可以 ...

您的意思是多做几个连接体系？还有就是我不知道怎么初步估计浓度，用凝胶成像系统从电泳上估计的话，初步估计的载体和目的片段的比为2-3吧，但是EB的涌动方向跟DNA相反，所以下面的胶很暗，而上面的胶很亮，两个背景不一样，这样比不太准确吧！
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10楼2011-08-12 09:17:15
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
1楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-11 20:32:26:
这是我酶切载体和目的基因以后切胶回收的电泳图，左边为载体，右边为目的片段，上样量均为2微升，有没有高手帮我看看我的连接体系中载体和目的片段怎么定量啊？我用的是宝生物的T4连接酶，25微升的体系加1微升的酶 ...

补充说明，目的片段283bp，载体5900bp！
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2楼2011-08-11 20:36:48
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
friya0910(金币+2): 2011-08-11 21:33:22
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-08-11 22:37:29
我们常用的链接体系是：载体1ul；目的片段3.5ul或6ul；NEB或全式金连接酶1ul；连接酶Buffer；加水补足到10ul；转化时，加入的感受态体积至少为50ul，楼主可以试一下，祝楼主顺利！
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jiayoubashaonian
3楼2011-08-11 20:57:06
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friya0910

新虫 (正式写手)
西瓜: 一般要计算摩尔比，具体可以在论坛里面搜一下 2011-08-11 22:38:09
引用回帖:
3楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-11 20:57:06:
我们常用的链接体系是：载体1ul；目的片段3.5ul或6ul；NEB或全式金连接酶1ul；连接酶Buffer；加水补足到10ul；转化时，加入的感受态体积至少为50ul，楼主可以试一下，祝楼主顺利！

可是连接体系中加入载体和目的片段的量不是要根据你的载体和目的片段的浓度来确定的么？好像是要最终换算成摩尔比的!貌似比较复杂啊！
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4楼2011-08-11 21:34:34
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