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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 请教二维电泳高手，如回答的好，另有重赏！！！！
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qingtingzhe

银虫 (正式写手)

步行者

[求助] 请教二维电泳高手，如回答的好，另有重赏！！！！

我现在做一株红球菌二维电泳，研究其受多环芳烃诱导的差异蛋白，通过差异蛋白寻找降解多环芳烃的降解基因。现在遇到一些问题：
   （1）超声破碎的功率和时间选择。由于红球菌是革兰氏阳性菌，破壁比较难，条件怎样选择？
   （2）影响蛋白样品制备的因素有哪些？有哪些注意事项，例如怎么除盐，怎么尽量减少蛋白的损失。
  （3）下面是我从文献中看到的方法，请提些建议：
（1）收集菌体。
（2）超声破碎。
（3）除去细胞碎屑和DNA。通过一步加入精胺，290000g高速离心。
（4）通过透析除去无机盐和小分子物质。
（5）-20度保存。
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1楼 2011-07-05 12:15:07
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xhjggl

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

qingtingzhe(金币+1): 2011-07-06 08:45:53
Perfect-FOCUS™(786-124)
2D电泳样品清除试剂
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2楼2011-07-06 00:16:21
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yangqi

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

qingtingzhe(金币+10): 两个超声的间隔要多久？ 2011-07-07 09:24:10
1.可以先用液氮研磨再超声，可能效果好些。我现在是直接研磨后用Tris-HCl提取。以前的超声条件：（200,5,5,8,）超声两次。
2.丙酮洗涤除盐的效果还不错，但是蛋白的损失好像有点大。减少蛋白损失的方法就是尽量用最少的步骤，因为，每一步，都可能把想要的蛋白损失了。
仅供参考~~~
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3楼2011-07-06 09:42:42
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qingtingzhe

银虫 (正式写手)

步行者
引用回帖:
Originally posted by yangqi at 2011-07-06 09:42:42:
1.可以先用液氮研磨再超声，可能效果好些。我现在是直接研磨后用Tris-HCl提取。以前的超声条件：（200,5,5,8,）超声两次。
2.丙酮洗涤除盐的效果还不错，但是蛋白的损失好像有点大。减少蛋白损失的方法就是尽量用 ...

请教你几个问题：
   1  两次超声的时间间隔多久？
   2  不知你用过超高速离心（290000g）吗？他能很好的出去杂质吗 ？
   3 透析除盐，效果怎样？我的蛋白不太多，会不会粘在膜上，造成蛋白损耗。

     劳驾了
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4楼2011-07-07 09:36:16
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superboring

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

qingtingzhe(金币+10): 对我有些启发,谢谢了 2011-07-07 20:47:22
建议使用frenchpress 或者 beadbeator， 对细胞膜与细胞壁的破碎比较彻底均匀。
先用低速离心去除其他杂质，使用超速离心容易分离膜蛋白与细胞质蛋白。
透析除盐，建议使用minicassette 透析膜，可以最少透析0。5ml的量
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5楼2011-07-07 16:12:02
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yangqi

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

qingtingzhe(金币+20): 帮助挺大的 2011-07-07 21:04:11
引用回帖:
Originally posted by qingtingzhe at 2011-07-07 09:36:16:
请教你几个问题：
   1  两次超声的时间间隔多久？
   2  不知你用过超高速离心（290000g）吗？他能很好的出去杂质吗 ？
   3 透析除盐，效果怎样？我的蛋白不太多，会不会粘在膜上，造成蛋白损耗。

    ...

不用说请教，呵呵，我做得也不是很多。
1.超声时间间隔十分钟，冰上超声。但是效果不是很好，可能我做的细菌壁太厚。最近准备用溶菌酶试试。
2.没有用过超速离心，我一般是13200r离心30min。好像超速离心机可以做不同蛋白的分级，我以前本来打算做细胞膜蛋白，就需要超速离心机。
3.透析可以除盐，还可以纯化，但是如果蛋白量本来不大，损耗是比较大的。当然纯度会比丙酮沉淀的高一些。要不你加大提取的量，透析之后，用冷冻干燥离心的方法减少体积，这样可以提高浓度。PS：我也没用过透析，师兄师姐都不建议用。
4.另外，打算跑双向的话，建议先用核酸酶处理下，防止横条纹的产生。
提蛋白时，整个过程保持低温、注意添加蛋白酶抑制剂.......
不然全降解完了。
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6楼2011-07-07 16:27:03
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qingtingzhe

银虫 (正式写手)

步行者
引用回帖:
Originally posted by superboring at 2011-07-07 16:12:02:
建议使用frenchpress 或者 beadbeator， 对细胞膜与细胞壁的破碎比较彻底均匀。
先用低速离心去除其他杂质，使用超速离心容易分离膜蛋白与细胞质蛋白。
透析除盐，建议使用minicassette 透析膜，可以最少透析0。 ...

请教你一个问题：
    我所感兴趣的蛋白是参与多环芳烃降解的蛋白，这类蛋白应该是细胞质蛋白，我看的那篇文献中290000g超高速离心，然后取上清。这样的话细胞质蛋白应该沉淀不下来吧？290000g离心应该只能沉淀膜蛋白吧？
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7楼2011-07-07 21:00:14
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qingtingzhe

银虫 (正式写手)

步行者
引用回帖:
Originally posted by yangqi at 2011-07-07 16:27:03:
不用说请教，呵呵，我做得也不是很多。
1.超声时间间隔十分钟，冰上超声。但是效果不是很好，可能我做的细菌壁太厚。最近准备用溶菌酶试试。
2.没有用过超速离心，我一般是13200r离心30min。好像超速离心机可 ...

再请教你几个问题：
1  刚才你提到加蛋白酶抑制剂，是加在超声破碎缓冲液中吗？我看的那篇文献中只加了0.01 M EDTA，感觉只加EDTA并不能完全抑制蛋白酶抑制剂。能给些建议吗？你一般加什么蛋白酶抑制剂？
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8楼2011-07-07 21:24:49
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yangqi

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

qingtingzhe(金币+10): 谢谢了 2011-07-09 16:01:30
引用回帖:
Originally posted by qingtingzhe at 2011-07-07 21:24:49:
再请教你几个问题：
1  刚才你提到加蛋白酶抑制剂，是加在超声破碎缓冲液中吗？我看的那篇文献中只加了0.01 M EDTA，感觉只加EDTA并不能完全抑制蛋白酶抑制剂。能给些建议吗？你一般加什么蛋白酶抑制剂？

我加的是PPMV，用乙醇或异丙醇溶解成终浓度为10mmol的溶液，分装小管，-20℃保存。用的时候，我是凭经验加几微升，加到研磨后的提取缓冲液中，一般是一毫升加五微升的样子，如果我打算提取久一点，就会多加一点点。离心用TCA/丙酮沉淀的时候，我加的是终浓度为0.07%的β-巯基乙醇，这个也有抑制蛋白降解的作用。以后每次用丙酮洗涤的时候，都要加。
EDTA的终浓度好像要加到2mM效果会好些~~~
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9楼2011-07-08 09:06:33
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yangqi

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yangqi at 2011-07-08 09:06:33:
我加的是PPMV，用乙醇或异丙醇溶解成终浓度为10mmol的溶液，分装小管，-20℃保存。用的时候，我是凭经验加几微升，加到研磨后的提取缓冲液中，一般是一毫升加五微升的样子，如果我打算提取久一点，就会多加一点 ...

写错了，是PMSF
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10楼2011-07-08 09:07:25
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