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qingtingzhe

银虫 (正式写手)

步行者

[求助] 请教二维电泳高手,如回答的好,另有重赏!!!!

我现在做一株红球菌二维电泳,研究其受多环芳烃诱导的差异蛋白,通过差异蛋白寻找降解多环芳烃的降解基因。现在遇到一些问题:
   (1)超声破碎的功率和时间选择。由于红球菌是革兰氏阳性菌,破壁比较难,条件怎样选择?
   (2)影响蛋白样品制备的因素有哪些?有哪些注意事项,例如怎么除盐,怎么尽量减少蛋白的损失。
  (3)下面是我从文献中看到的方法,请提些建议:
(1)收集菌体。
(2)超声破碎。
(3)除去细胞碎屑和DNA。通过一步加入精胺,290000g高速离心。
(4)通过透析除去无机盐和小分子物质。
(5)-20度保存。
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人的上半生不要犹豫,下半生不要后悔
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qingtingzhe

银虫 (正式写手)

步行者

引用回帖:
Originally posted by yangqi at 2011-07-06 09:42:42:
1.可以先用液氮研磨再超声,可能效果好些。我现在是直接研磨后用Tris-HCl提取。以前的超声条件:(200,5,5,8,)超声两次。
2.丙酮洗涤除盐的效果还不错,但是蛋白的损失好像有点大。减少蛋白损失的方法就是尽量用 ...

请教你几个问题:
   1  两次超声的时间间隔多久?
   2  不知你用过超高速离心(290000g)吗?他能很好的出去杂质吗 ?
   3 透析除盐,效果怎样?我的蛋白不太多,会不会粘在膜上,造成蛋白损耗。

     劳驾了
人的上半生不要犹豫,下半生不要后悔
4楼2011-07-07 09:36:16
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xhjggl

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

qingtingzhe(金币+1): 2011-07-06 08:45:53
Perfect-FOCUS™(786-124)
2D电泳样品清除试剂
2楼2011-07-06 00:16:21
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yangqi

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

qingtingzhe(金币+10): 两个超声的间隔要多久? 2011-07-07 09:24:10
1.可以先用液氮研磨再超声,可能效果好些。我现在是直接研磨后用Tris-HCl提取。以前的超声条件:(200,5,5,8,)超声两次。
2.丙酮洗涤除盐的效果还不错,但是蛋白的损失好像有点大。减少蛋白损失的方法就是尽量用最少的步骤,因为,每一步,都可能把想要的蛋白损失了。
仅供参考~~~
人生,只有坚强,才能美好!
3楼2011-07-06 09:42:42
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superboring

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

qingtingzhe(金币+10): 对我有些启发,谢谢了 2011-07-07 20:47:22
建议使用frenchpress 或者 beadbeator, 对细胞膜与细胞壁的破碎比较彻底均匀。
先用低速离心去除其他杂质,使用超速离心容易分离膜蛋白与细胞质蛋白。
透析除盐,建议使用minicassette 透析膜,可以最少透析0。5ml的量
5楼2011-07-07 16:12:02
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