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qingtingzhe

银虫 (正式写手)

步行者

[求助] 请教二维电泳高手,如回答的好,另有重赏!!!!

我现在做一株红球菌二维电泳,研究其受多环芳烃诱导的差异蛋白,通过差异蛋白寻找降解多环芳烃的降解基因。现在遇到一些问题:
   (1)超声破碎的功率和时间选择。由于红球菌是革兰氏阳性菌,破壁比较难,条件怎样选择?
   (2)影响蛋白样品制备的因素有哪些?有哪些注意事项,例如怎么除盐,怎么尽量减少蛋白的损失。
  (3)下面是我从文献中看到的方法,请提些建议:
(1)收集菌体。
(2)超声破碎。
(3)除去细胞碎屑和DNA。通过一步加入精胺,290000g高速离心。
(4)通过透析除去无机盐和小分子物质。
(5)-20度保存。
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yangqi

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

qingtingzhe(金币+10): 谢谢了 2011-07-09 16:01:30
引用回帖:
Originally posted by qingtingzhe at 2011-07-07 21:24:49:
再请教你几个问题:
1  刚才你提到加蛋白酶抑制剂,是加在超声破碎缓冲液中吗?我看的那篇文献中只加了0.01 M EDTA,感觉只加EDTA并不能完全抑制蛋白酶抑制剂。能给些建议吗?你一般加什么蛋白酶抑制剂?

我加的是PPMV,用乙醇或异丙醇溶解成终浓度为10mmol的溶液,分装小管,-20℃保存。用的时候,我是凭经验加几微升,加到研磨后的提取缓冲液中,一般是一毫升加五微升的样子,如果我打算提取久一点,就会多加一点点。离心用TCA/丙酮沉淀的时候,我加的是终浓度为0.07%的β-巯基乙醇,这个也有抑制蛋白降解的作用。以后每次用丙酮洗涤的时候,都要加。
EDTA的终浓度好像要加到2mM效果会好些~~~
人生,只有坚强,才能美好!
9楼2011-07-08 09:06:33
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xhjggl

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

qingtingzhe(金币+1): 2011-07-06 08:45:53
Perfect-FOCUS™(786-124)
2D电泳样品清除试剂
2楼2011-07-06 00:16:21
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yangqi

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

qingtingzhe(金币+10): 两个超声的间隔要多久? 2011-07-07 09:24:10
1.可以先用液氮研磨再超声,可能效果好些。我现在是直接研磨后用Tris-HCl提取。以前的超声条件:(200,5,5,8,)超声两次。
2.丙酮洗涤除盐的效果还不错,但是蛋白的损失好像有点大。减少蛋白损失的方法就是尽量用最少的步骤,因为,每一步,都可能把想要的蛋白损失了。
仅供参考~~~
人生,只有坚强,才能美好!
3楼2011-07-06 09:42:42
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qingtingzhe

银虫 (正式写手)

步行者

引用回帖:
Originally posted by yangqi at 2011-07-06 09:42:42:
1.可以先用液氮研磨再超声,可能效果好些。我现在是直接研磨后用Tris-HCl提取。以前的超声条件:(200,5,5,8,)超声两次。
2.丙酮洗涤除盐的效果还不错,但是蛋白的损失好像有点大。减少蛋白损失的方法就是尽量用 ...

请教你几个问题:
   1  两次超声的时间间隔多久?
   2  不知你用过超高速离心(290000g)吗?他能很好的出去杂质吗 ?
   3 透析除盐,效果怎样?我的蛋白不太多,会不会粘在膜上,造成蛋白损耗。

     劳驾了
人的上半生不要犹豫,下半生不要后悔
4楼2011-07-07 09:36:16
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