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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 镍柱纯化蛋白透析出现大量沉淀，请教
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

[交流] 镍柱纯化蛋白透析出现大量沉淀，请教 已有14人参与

昨晚镍柱纯化两个蛋白（脂肪酶），上样量为20ml镍柱纯化1L菌液破碎上清（80ml），最后用50ml  500mM咪唑（50mM Tris·Hcl，0.5mM Nacl，10%甘油  ）洗脱，透析：（1）50mM Tris·Hcl，0.2mM Nacl  3L 透析3h，开始出现沉淀；（2）50mM Tris·Hcl，0.03mM Nacl，3L透析不到1h，就出现比较多的沉淀了，7h后出现大量沉淀。透析一直在4℃下搅拌进行。请教各位高手，是我蛋白变性太快了还是透析过程中什么因素引起的，谢谢
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jinpeng_6118

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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
1楼 2011-06-30 10:31:09
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toxicpeach

木虫 (正式写手)
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看天(金币+4): 鼓励回答 2011-06-30 15:59:12
silicare(EPI+1): 2011-07-05 12:17:08
像楼上讲的一样，你的NaCl浓度不对吧。另外，作为保护剂的甘油不能一次透析掉，最好配几个梯度的缓冲液，NaCl和甘油的浓度逐步缓慢降低，一般要换3-4次液体，就是说你可以配置4个梯度左右。溶液成分不能变得太剧烈了。咪唑浓度变化剧烈有没有影响我就不清楚了，要是觉得透析的方法不好的话就用脱盐柱或者超滤的方法换液要稍微温和一些。
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海纳百川有容乃大，壁立千尺无欲则刚
4楼2011-06-30 15:26:16
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)
谢谢各位的建议，我这个蛋白试验发现在有机溶剂中比较稳定，我在透析时，加入了5%的乙醇，同时咪唑洗脱浓度降低250mM，纯化回来了。
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
16楼2011-07-11 09:24:05
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
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看天(金币+3): 鼓励回答 2011-06-30 15:58:51
兄弟，搞错没有，是0.5mM， 0.2mM 的NaCl 还是0.5M，0.2M。。。。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2011-06-30 14:46:36
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
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看天(金币+2): 鼓励回答 2011-06-30 15:59:03
很怪异，500mM那么高的咪唑洗脱，只洗了2.5倍柱床体积。0.03mM Nacl那么低，我怀疑是30mM。不过可能楼主的实验就是要求这样的。
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3楼2011-06-30 15:01:07
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)
送鲜花一朵
Nacl的终浓度为0.5mM， 0.2mM 。我是怕后几次换透析液Na+浓度高了透析效果不好，所以就把Nacl降的很低 了。问下脱盐柱的效果怎么样，正在考虑要买呢
  透析沉淀最多的那个样品离心后测了下酶活反应，活性还是挺高的。
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gdxinlan
人生百态原为海，看破红尘方为岸！
5楼2011-06-30 18:53:50
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gdxinlan

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★
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送鲜花一朵
silicare(金币+2): 谢谢参与 2011-07-05 12:19:29
本帖内容被屏蔽
6楼2011-06-30 20:14:41
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gwbk

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
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silicare(金币+4, EPI+1): 另辟蹊径 2011-07-05 12:19:20
我来另辟蹊径
1，pET蛋白表达量过高，蛋白浓度太大。
2，脂肪酶亲水也亲脂，量稍大就聚集。
只要活性高就行了。没必要这么纠结。
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7楼2011-06-30 21:42:39
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toxicpeach

木虫 (正式写手)
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silicare(金币+4): 谢谢参与 2011-07-05 12:18:57
我师妹做酶是用的脱盐柱去咪唑，但是脱盐后也是加了10%甘油的，效果还不错，比透析省时省力。你需要自己摸索条件。上样量不要太大了，要是脱盐后稀释太多，可以用超滤浓缩，我师妹做的效果不错。
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海纳百川有容乃大，壁立千尺无欲则刚
8楼2011-07-01 00:02:32
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
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silicare(金币+2): 谢谢参与 2011-07-05 12:18:44
估计是NaCl浓度降低后引起的蛋白聚集
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9楼2011-07-01 00:14:28
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
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silicare(金币+2): 谢谢参与 2011-07-05 12:18:35
脱盐很快的，而且容积变化不大，最多为原来的三倍，我做的时候是1.5倍。
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10楼2011-07-04 16:57:41
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