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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 镍柱纯化蛋白透析出现大量沉淀，请教
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

[交流] 镍柱纯化蛋白透析出现大量沉淀，请教 已有14人参与

昨晚镍柱纯化两个蛋白（脂肪酶），上样量为20ml镍柱纯化1L菌液破碎上清（80ml），最后用50ml  500mM咪唑（50mM Tris·Hcl，0.5mM Nacl，10%甘油  ）洗脱，透析：（1）50mM Tris·Hcl，0.2mM Nacl  3L 透析3h，开始出现沉淀；（2）50mM Tris·Hcl，0.03mM Nacl，3L透析不到1h，就出现比较多的沉淀了，7h后出现大量沉淀。透析一直在4℃下搅拌进行。请教各位高手，是我蛋白变性太快了还是透析过程中什么因素引起的，谢谢
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jinpeng_6118

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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
1楼 2011-06-30 10:31:09
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)
谢谢各位的建议，我这个蛋白试验发现在有机溶剂中比较稳定，我在透析时，加入了5%的乙醇，同时咪唑洗脱浓度降低250mM，纯化回来了。
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
16楼2011-07-11 09:24:05
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★ ★ ★ ★
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看天(金币+3): 鼓励回答 2011-06-30 15:58:51
兄弟，搞错没有，是0.5mM， 0.2mM 的NaCl 还是0.5M，0.2M。。。。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2011-06-30 14:46:36
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
看天(金币+2): 鼓励回答 2011-06-30 15:59:03
很怪异，500mM那么高的咪唑洗脱，只洗了2.5倍柱床体积。0.03mM Nacl那么低，我怀疑是30mM。不过可能楼主的实验就是要求这样的。
赞一下(2人) 回复此楼
流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
3楼2011-06-30 15:01:07
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toxicpeach

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
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看天(金币+4): 鼓励回答 2011-06-30 15:59:12
silicare(EPI+1): 2011-07-05 12:17:08
像楼上讲的一样，你的NaCl浓度不对吧。另外，作为保护剂的甘油不能一次透析掉，最好配几个梯度的缓冲液，NaCl和甘油的浓度逐步缓慢降低，一般要换3-4次液体，就是说你可以配置4个梯度左右。溶液成分不能变得太剧烈了。咪唑浓度变化剧烈有没有影响我就不清楚了，要是觉得透析的方法不好的话就用脱盐柱或者超滤的方法换液要稍微温和一些。
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海纳百川有容乃大，壁立千尺无欲则刚
4楼2011-06-30 15:26:16
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