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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 重组蛋白聚集
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paulajjh

木虫 (著名写手)

[交流] 重组蛋白聚集

各位虫友，最近表达了一种人源的蛋白，在大肠中表达，采用亲和柱纯化后本打算超滤浓缩，然后透析除盐的，可是在超滤与除盐的过程中一直出现白色絮状物，我觉得有可能是蛋白聚集了，但我很担心，照这样聚集下去，酶活要全部没掉了。
各位如有出现过类似的现象，可否告诉我为什么会一直出现聚集的现象，如何防止这种聚集。
谢谢。
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1楼 2011-06-08 16:50:57
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thinkingers

金虫 (小有名气)
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amisking(金币+3): 鼓励分享经验 2011-06-08 20:27:43
paulajjh(金币+3): 谢谢 2011-06-09 10:35:55
我做过重组降糖多肽的表达，浓缩的时候用的是透析袋，分子量不大，外面用分子量2W的聚乙二醇来吸水

透析除盐，怎么透析的？用超纯水、透析袋？是在哪个地方，比如透析袋内还是外中有白色絮状物？
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2楼2011-06-08 17:20:31
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dreamofyou

银虫 (小有名气)
★
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paulajjh(金币+3): 非常感谢,可否给我你师妹的联系方式? 2011-06-09 11:50:06
我师妹的一个蛋白就是透析会沉淀，然后她用脱盐柱除盐的，速度快，效果好～
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4楼2011-06-09 10:40:22
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101202139

铜虫 (小有名气)
★
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paulajjh(金币+2): 2011-07-08 15:54:41
透析的过程中出现沉淀，原因有以下几种可能：
一、看看你重组蛋白的等电点是不是与你的透析液的pH值差不多，蛋白在等电点是很容易沉淀的。
二、你的蛋白浓度可能太大了，透析过程中，盐浓度的相对变化会造成盐析。
另外蛋白沉淀了，活性还是有的，你可以加一些缓冲液进行溶解。
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6楼2011-07-08 15:30:26
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paulajjh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by thinkingers at 2011-06-08 17:20:31:
我做过重组降糖多肽的表达，浓缩的时候用的是透析袋，分子量不大，外面用分子量2W的聚乙二醇来吸水

透析除盐，怎么透析的？用超纯水、透析袋？是在哪个地方，比如透析袋内还是外中有白色絮状物？

用透析袋除盐，里面为亲和柱后的液体，外面为低盐缓冲液，袋中有白色絮状物。
有一位同事说是没关系，继续透，透到平衡了就不再有聚集了，我透到今天为止，已经2天了，一直有白色絮状物出现。
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3楼2011-06-09 10:37:45
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paulajjh

木虫 (著名写手)
继续求助，求各位英才解答
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5楼2011-07-08 14:22:27
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paulajjh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 101202139 at 2011-07-08 15:30:26:
透析的过程中出现沉淀，原因有以下几种可能：
一、看看你重组蛋白的等电点是不是与你的透析液的pH值差不多，蛋白在等电点是很容易沉淀的。
二、你的蛋白浓度可能太大了，透析过程中，盐浓度的相对变化会造成盐析 ...

可以排除等电点沉淀，蛋白浓度5mg/mL的容易聚沉，聚沉到1mg/L还在聚沉，另外，聚沉后的蛋白完全不能溶解了，也没有酶活了
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7楼2011-07-08 15:56:09
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whb8161

木虫 (小有名气)
paulajjh(金币+2): 2011-07-08 17:31:30
加10%甘油试试
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8楼2011-07-08 16:03:56
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xuyihui2001

银虫 (正式写手)
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paulajjh(金币+3): 2011-07-08 17:32:55
我建议加5%的甘油，蛋白可以梯度透析，即不要一次透析到目的盐溶液中，逐步降低透析袋外的盐浓度。
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9楼2011-07-08 16:28:17
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paulajjh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by whb8161 at 2011-07-08 16:03:56:
加10%甘油试试

我加了10%甘油，还聚沉，我一狠心，加了30%，现在正在做，可是感觉慢慢甘油都被透析出去了，不知道结果会怎样。
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10楼2011-07-08 17:32:29
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paulajjh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by xuyihui2001 at 2011-07-08 16:28:17:
我建议加5%的甘油，蛋白可以梯度透析，即不要一次透析到目的盐溶液中，逐步降低透析袋外的盐浓度。

好主意，我以后试一下梯度透析，就是很耗神了。
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11楼2011-07-08 17:33:38
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whb8161

木虫 (小有名气)
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paulajjh(金币+2): 2011-07-09 08:32:58
引用回帖:
Originally posted by paulajjh at 2011-07-08 17:32:29:
我加了10%甘油，还聚沉，我一狠心，加了30%，现在正在做，可是感觉慢慢甘油都被透析出去了，不知道结果会怎样。

那还是过脱盐柱吧，AKTA上半小时就能过完。
甘油浓度太高也不好，pH敏感吗？
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12楼2011-07-08 19:51:26
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paulajjh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by whb8161 at 2011-07-08 19:51:26:
那还是过脱盐柱吧，AKTA上半小时就能过完。
甘油浓度太高也不好，pH敏感吗？

pH不敏感，现在也用了脱盐柱，脱盐效果还好，就是处理量太小，另外，脱盐后还是会出现聚沉的现象。
还得继续找原因。
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13楼2011-07-09 08:34:06
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whb8161

木虫 (小有名气)
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引用回帖:
Originally posted by paulajjh at 2011-07-09 08:34:06:
pH不敏感，现在也用了脱盐柱，脱盐效果还好，就是处理量太小，另外，脱盐后还是会出现聚沉的现象。
还得继续找原因。

那可能说明你的蛋白依赖高盐，你脱盐的buffer盐浓度多高？如果太低建议提高buffer的盐浓度。另外，如果你做的是核里的蛋白，很多都是需要高盐的
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14楼2011-07-09 09:29:51
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paulajjh

木虫 (著名写手)
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Originally posted by whb8161 at 2011-07-09 09:29:51:
那可能说明你的蛋白依赖高盐，你脱盐的buffer盐浓度多高？如果太低建议提高buffer的盐浓度。另外，如果你做的是核里的蛋白，很多都是需要高盐的

核里的蛋白是什么概念？
我脱盐buffer盐浓度为100mM氯化钠，原始含500mM 氯化钠，500mM 咪唑。
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15楼2011-07-09 11:12:48
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whb8161

木虫 (小有名气)
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
就是定位在核内的蛋白。
如果100mM的盐还沉的话，可以换200mM的盐试试
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16楼2011-07-09 19:58:40
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cheng910323

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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15楼: Originally posted by paulajjh at 2011-07-09 11:12:48
核里的蛋白是什么概念？
我脱盐buffer盐浓度为100mM氯化钠，原始含500mM 氯化钠，500mM 咪唑。...

请问 最后这么解决的？
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17楼2023-01-31 11:07:55
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