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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR问题求助，感谢大家
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ahdongn

木虫 (小有名气)

使者

[求助] PCR问题求助，感谢大家

大家好！我现在PCR，做人血的基因组，预试验结果挺好的，现在正式实验了，反而不好了，有一个现象就是空白对照（未加模板）出现目的条带，是不是考虑污染了？昨天买了有滤蕊的枪头，重全成的引物，在试剂公司买的TE溶的引物，买的去离子水，空白对照还是有条带，不知道什么原因？是污染还是引物特异性不好！
上游 5’-ataatgtaagctcatccacc-3’
下游 5’-gagattgcatttctgtcagt-3’

这是我的引物序列，目的条带是350BP,空白出现的也是差不多。谢谢大家
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1楼 2011-05-26 09:52:32
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yabxxh

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
ahdongn(金币+1): 谢谢！我不会用BLAST,能否帮个忙！ 2011-05-26 10:40:31
1949stone(金币+3): 有道理 2011-05-26 11:19:41
一个考虑是引物特异性的问题，因为你用的基因组，建议做一下引物blast
一个考虑实验室空气污染的原因，建议换个实验室，或者到别的实验室做，另插枪头的时候，要带手套。
好运
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2楼2011-05-26 10:34:16
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ahdongn

木虫 (小有名气)

使者
1949stone: 引物的特异性 很关键 不过你的空白p出来了 说明是污染了 全换一套 试试 要是还不行 建议换个实验室做一下 看看是不是你们实验室空气有问题 不郭这个原因微乎其微 2011-05-26 11:21:27
麻烦高手分析一下引物，万分感谢！
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3楼2011-05-26 10:51:09
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): 不错 2011-05-30 12:58:49
我的看法跟1949stone版主说的一样，把全套都换了，酶、buffer、dNTP、镁离子、水，引物也可以重新稀释。东西都不贵，可以一次就换全套，如果一样一样的试，代价太大。我以前就出现过dNTP出问题P不出来的情况。
你说的空白对照的条带跟目的片段一样吗？
还有，模板时一样的还是重新提取的？
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4楼2011-05-26 12:38:00
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ahdongn

木虫 (小有名气)

使者
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-05-26 12:38:00:
我的看法跟1949stone版主说的一样，把全套都换了，酶、buffer、dNTP、镁离子、水，引物也可以重新稀释。东西都不贵，可以一次就换全套，如果一样一样的试，代价太大。我以前就出现过dNTP出问题P不出来的情况。
你 ...

谢谢！
我用的是MIX，新换了一个，但没有换牌子，引物是重新合成的，水没有用实验室的，直接在试剂公司买的！现在就差换枪和MIX了！空白的带比样品的带倒是浅一点，DNA还是和预试时的一样！
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5楼2011-05-26 13:58:02
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
Originally posted by ahdongn at 2011-05-26 13:58:02:
谢谢！
我用的是MIX，新换了一个，但没有换牌子，引物是重新合成的，水没有用实验室的，直接在试剂公司买的！现在就差换枪和MIX了！空白的带比样品的带倒是浅一点，DNA还是和预试时的一样！

……看看PCR程序有没有错吧。
我是没辙咯，高手们上啊！
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6楼2011-05-26 14:43:21
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yabxxh

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-05-30 12:59:11
引物特异性我刚blast了一下，如果你只是350的片段的话，在人基因组里面是特异的，因此建议排除引物特异性的问题。
东西全换掉是必需的，这里不但包括试剂，还包括你的枪头和PCR管，因为我知道有些人插枪头是不带手套的。
因为你P的是人的基因组DNA，所以你自己身上的东西也极有可能成为模板，带上口罩，手套，再做一遍，不行就拿别人的一套东西做个对照。
还有一种可能，是你加样的时候，跑到临边的孔里的，当然了这种可能非常小，但是也是存在的，希望也能注意一下。
最后建议，加单一引物作对照，即加一对引物中的一条，确认是不是模板的问题。
好运。
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7楼2011-05-26 15:39:13
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yinbaoling

新虫 (初入文坛)
很显然是引物的问题，建议重新设计引物
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8楼2011-05-29 14:15:45
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