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ahdongn

木虫 (小有名气)

使者

[求助] PCR问题求助,感谢大家

大家好!我现在PCR,做人血的基因组,预试验结果挺好的,现在正式实验了,反而不好了,有一个现象就是空白对照(未加模板)出现目的条带,是不是考虑污染了?昨天买了有滤蕊的枪头,重全成的引物,在试剂公司买的TE溶的引物,买的去离子水,空白对照还是有条带,不知道什么原因?是污染还是引物特异性不好!
上游 5’-ataatgtaagctcatccacc-3’
下游 5’-gagattgcatttctgtcagt-3’

这是我的引物序列,目的条带是350BP,空白出现的也是差不多。谢谢大家
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ahdongn

木虫 (小有名气)

使者

1949stone: 引物的特异性 很关键 不过你的空白p出来了 说明是污染了 全换一套 试试 要是还不行 建议换个实验室做一下 看看是不是你们实验室空气有问题 不郭这个原因微乎其微 2011-05-26 11:21:27
麻烦高手分析一下引物,万分感谢!
3楼2011-05-26 10:51:09
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yabxxh

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
ahdongn(金币+1): 谢谢!我不会用BLAST,能否帮个忙! 2011-05-26 10:40:31
1949stone(金币+3): 有道理 2011-05-26 11:19:41
一个考虑是引物特异性的问题,因为你用的基因组,建议做一下引物blast
一个考虑实验室空气污染的原因,建议换个实验室,或者到别的实验室做,另插枪头的时候,要带手套。
好运
2楼2011-05-26 10:34:16
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

★ ★ ★
dhd997(金币+3): 不错 2011-05-30 12:58:49
我的看法跟1949stone版主说的一样,把全套都换了,酶、buffer、dNTP、镁离子、水,引物也可以重新稀释。东西都不贵,可以一次就换全套,如果一样一样的试,代价太大。我以前就出现过dNTP出问题P不出来的情况。
你说的空白对照的条带跟目的片段一样吗?
还有,模板时一样的还是重新提取的?
4楼2011-05-26 12:38:00
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ahdongn

木虫 (小有名气)

使者

引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-05-26 12:38:00:
我的看法跟1949stone版主说的一样,把全套都换了,酶、buffer、dNTP、镁离子、水,引物也可以重新稀释。东西都不贵,可以一次就换全套,如果一样一样的试,代价太大。我以前就出现过dNTP出问题P不出来的情况。
你 ...

谢谢!
我用的是MIX,新换了一个,但没有换牌子,引物是重新合成的,水没有用实验室的,直接在试剂公司买的!现在就差换枪和MIX了!空白的带比样品的带倒是浅一点,DNA还是和预试时的一样!
5楼2011-05-26 13:58:02
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