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liuwei78

铜虫 (小有名气)

[求助] 关于菌液PCR

最近做了一批平端连接转化进大肠杆菌感受态细胞的实验。含有氨苄的平板上一天后有菌落分布，不是那么分散，属于聚集在一起一团一团的。不好挑单菌落我就多个菌落一起挑，50mlLB加氨苄摇床培养，但是摇了快一天的都没有出现浑浊，请问大家这主要是什么原因？
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1楼 2011-05-12 16:20:19
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

liuwei78(金币+5): 2011-05-13 08:41:18
应该是没有涂布均匀，再加上培养时间可能稍微有些长，长出了微卫星菌落，这些菌落并没有含有你的质粒。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
3楼2011-05-12 17:16:44
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beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): Good! 2011-05-12 17:17:40
引用回帖:
Originally posted by liuwei78 at 2011-05-12 16:20:19:
最近做了一批平端连接转化进大肠杆菌感受态细胞的实验。含有氨苄的平板上一天后有菌落分布，不是那么分散，属于聚集在一起一团一团的。不好挑单菌落我就多个菌落一起挑，50mlLB加氨苄摇床培养，但是摇了快一天的都 ...

菌落分布不均匀，应该是你涂平板的时候没有涂抹均匀，首先要确定你的平板培养基是否加了氨苄（别以为加了而实际上是忘了加，做实验做多了也会晕的~），不然就是假阳性菌落，然后就是正确的转化，将转进感受态细胞后的混合液加入300μL LB液体培养基，37℃ 220 rpm培养1-2h。然后吸100μL菌液涂布含Amp平板培养基的LB固体培养基平板， 37℃ 培养16－24h。挑单菌落含约5ml液体培养基（含氨苄）的试管中，37℃ 220 rpm培养约12-14小时（晚上培养，第二天上午可以看到浑浊，如果要提转化进去的质粒的话，则可以将试管中的细菌悬液约1ml加入到50ml-200ml的液体培养基（含氨苄），37℃ 220 rpm培养，大约3小时即可浑浊，附上一般的培养流程:
(1) 将10μL连接液移入含200μL感受态细胞的1.5mL dorf管中，冰浴30-60min。
(2) 42℃水浴热激90sec后，立即再冰浴5min。
(3) 加入300μL LB液体培养基，37℃ 220 rpm培养1-2h。
(4) 吸100μL菌液涂布含Amp平板培养基的LB固体培养基平板， 37℃ 培养16－24h。
(5)用接种环挑起单菌落于5ml液体培养基（含氨苄）的试管中，37℃ 220 rpm培养约12-14小时，可看到菌落。
注意：用接种环挑单菌落的时候，用酒精灯烧接种环后要冷却一会，不然挑菌落的时候可能会把细菌烫死了~也可能会出现没有浑浊的情况~
祝实验顺利~
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2楼2011-05-12 16:53:53
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lly198784

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

liuwei78(金币+5): 2011-05-13 08:41:29
我觉得是你没有涂开，一般不要超过200ul涂布，还有你的抗生素确定没有问题吧。我以前出现过抗生素失效的情况，你可以找个没有氨苄抗性的菌试试你的抗生素有无失效。
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4楼2011-05-12 17:27:43
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